Почему проверка нулевой гипотезы важна для количественного определения поглощения микроглией?

Проверка нулевой гипотезы гарантирует, что наблюдаемые различия в фагоцитозе микроглии являются статистически значимыми, что обеспечивает надежную валидацию мишени и сокращает количество ложноположительных результатов на ранних этапах поиска.

Как изоляция независимой переменной вписывается в рабочий процесс проточной цитометрии?

Изоляция таких переменных, как тип клеток и жизнеспособность, с помощью специфического мечения антителами и гейтирования позволяет точно attributed фагоцитарную активность микроглии, что углубляет понимание механизмов процесса.

Что позволяют определить количественные измерения зависимой переменной в данном анализе?

Количественные измерения флуоресценции позволяют напрямую сравнивать поглощение микроглией при различных условиях, что способствует принятию обоснованных решений при скрининге и приоритизации мишеней.

Почему требования к репликации имеют критическое значение для кросс-функционального взаимодействия?

Воспроизведение результатов проточной цитометрии в различных экспериментах и группами исследователей обеспечивает воспроизводимость, что позволяет надежно обмениваться данными и интегрировать их в более широкие рабочие процессы НИОКР.

Какие возможности статистического анализа требуются перед внедрением считывания данных проточной цитометрии?

Для анализа многопараметрических данных проточной цитометрии, оценки значимости и валидации результатов для принятия последующих решений в биофармацевтических разработках необходимы надежные статистические инструменты.

Измерение поглощения микроглией интравитреально доставляемых флуоресцентных частиц с помощью проточной цитометрии

JoVE Encyclopedia of Experiments

Иммунология

0 просмотров • 4:34 мин • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Начните с многолуночного планшета, содержащего одноклеточную суспензию миелоидных клеток сетчатки мыши, включая микроглию, моноциты и нейтрофилы.

Микроглия — или фагоцитарные иммунные клетки сетчатки, проявляют флуоресценцию за счет поглощенных флуорофорами меченых биочастиц грибкового происхождения, предварительно вводимых интравитреально.

Центрифугируйте и добавьте антитела к Fc-рецепторам, блокируя неспецифические сайты взаимодействия».

Ввести коктейль меченых флуорофорами антител, нацеленных на поверхностные белки CD11b, Ly6C и Ly6G, взаимодействующих с миелоидными клетками, экспрессирующими их.

Удалите несвязанные антитела. Обрабатывайте йодидом пропидия, который проникает через поврежденные мембраны, окрашивая исключительно омертвевшие клетки.

При проточной цитометрии возбуждайте йодидом пропидия для исключения мертвых клеток и идентификации нефлуоресцентных живых клеток.

Осветите клетки фиолетовым лазером; возбужденные живые клетки обозначают миелоидные клетки, экспрессирующие CD11b.

Затем посветите красным лазером, возбуждая ближний красный флуорофор в CD11b-положительных клетках, указывающий на моноциты, экспрессирующие Ly6C, и нейтрофилы, экспрессирующие Ly6G.

Возбуждайте клетки синим лазером; излучение зеленой флуоресценции от оставшихся CD11b-положительных клеток подтверждает микроглиальное поглощение флуоресцентных частиц.

Через три часа после интравитреальной инъекции используйте щипцы под углом 45 градусов, чтобы мягко надавить на веко, чтобы проптоизировать глазное яблоко. Расположите щипцы за глазным яблоком и потяните. Затем перенесите глазное яблоко в сухую область чашки Петри, содержащую небольшой объем PBS с кальцием и магнием, под препарирующим микроскопом и используйте один кончик сверхтонких щипцов для перфорации глаза в лимбе роговицы. Затем, удерживая глазное яблоко тонкими щипцами под углом 45 градусов, используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать вокруг лимба роговицы, пока не будет разрезана примерно половина окружности.

Перенесите глазное яблоко в PBS и используйте вторую пару тонких щипцов под углом 45 градусов, чтобы разорвать роговицу и склеру на части. Хрусталик и сетчатка кожи выйдут неповрежденными. Убедитесь, что хрусталик и сетчатка отделены друг от друга, и перенесите сетчатку в полистирольную пробирку объемом 5,4 миллилитра, содержащую 2 миллилитра PBS с кальцием и магнием.

Чтобы получить одноклеточную суспензию клеток сетчатки, используйте набор для диссоциации нейрональной ткани в соответствии с инструкциями производителя и ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах окрашивающего буфера. Затем перенесите образец в одну лунку 96-луночной U-образной нижней пластины. После центрифугирования переверните планшет, чтобы отбросить надосадочную жидкость, и заблокируйте рецепторы FC 25 микролитрами буфера красителя, содержащего антитела CD16/CD32, на лунку на 5 минут при комнатной температуре. Далее пометьте клетки интересующими вас антителами в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.

Затем гранулируйте

ячейки и после этого промойте 200 микролитрами свежего буфера для окрашивания на лунку. Теперь ресуспендируйте гранулы в 200 микролитрах буфера для окрашивания и красителя для повышения жизнеспособности и перенесите образцы в пробирки с микротитром объемом 1,2 миллилитра. Затем промойте лунки дополнительными 100 микролитрами красителя для окрашивания и красителя жизнеспособности и объедините промывки с соответствующими образцами для анализа методом проточной цитометрии.