Использование зондов напряжения на основе ДНК для оценки рецепторных сил, прилагаемых иммунными клетками

Начните с функционализированного стеклянного покровного стекла с наночастицами золота, закрепленными полиэтиленгликолем.

Добавьте зонды натяжения шпильки ДНК, содержащие шпильку ДНК, гибридизированную с двумя олигонуклеотидами в противоположных плечах.

Цепь лиганда включает флуорофор и биотин, в то время как якорная цепь содержит гаситель и тиоловую группу. В этой конфигурации гаситель подавляет флуоресценцию.

Зонды ДНК связываются с наночастицами золота, крепясь к стеклянной покровной крышке.

Вводят стрептавидин, взаимодействующий с молекулами биотина нитей лиганда.

Добавьте биотинилированные лиганды, которые связываются с предварительно связанными молекулами стрептавидина.

Наложите на покровное стекло CD8-положительные Т-клетки, рецепторы которых взаимодействуют с иммобилизованными лигандами, образуя сайт взаимодействия рецептор-лиганд.

Это взаимодействие создает силу, которая разворачивает структуру шпильки ДНК, отделяя флуорофор от гасителя и способствуя излучению флуоресценции.

Введите нефлуоресцентные блокирующие цепи, которые взаимодействуют с развернутыми сегментами зондов для сохранения сигнала флуоресценции.

Количественно оцените флуоресценцию для оценки рецепторных сил, прилагаемых иммунными клетками.

Для начала поместите 25-миллиметровые покровные стекла на политетрафторэтиленовую решетку в 50-миллилитровом стакане и трижды промойте покровные стекла, погрузив их в воду. Смешайте равные объемы этанола и воды и добавьте 40 миллилитров этого раствора в стакан, в котором находится решетка и покровные стекла. Затем заклейте стакан с помощью парапленочной ленты.

Очистите покровные стекла, проработав стакан ультразвуком в течение 15 минут в ультразвуковом очистителе, и выбросьте жидкость после обработки ультразвуком. Затем промойте стакан с решеткой и покровными стеклами водой, по крайней мере, шесть раз, чтобы удалить остатки органического растворителя. Чтобы приготовить свежий раствор пираньи, добавьте в 30-миллилитровый стакан 50 миллилитров серной кислоты и медленно добавьте 10 миллилитров перекиси водорода. Аккуратно перемешайте раствор пираньи с помощью конца стеклянной пипетки.

Чтобы начать травление, перенесите стойку, на которой хранятся покровные стекла, в стакан с раствором пираньи и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы очистить и гидроксилировать покровные стекла. Затем перенесите решетку с помощью стального или политетрафторэтиленового пинцета в чистый 50-миллилитровый стакан и промойте водой шесть раз. Для того, чтобы полностью удалить воду, погрузите решетку с покровными стеклами в 50-миллилитровый стакан с 40 миллилитрами этанола, затем выбросьте этанол.

Далее погрузите штатив в 40 миллилитров этанола, содержащего 3% аминопропилтриэтоксисилана, на 1 час при комнатной температуре, чтобы инициировать реакцию с гидроксильной группой на покровных стеклах. Промойте поверхность покровных стекол шесть раз, погрузив их в 40 миллилитров этанола, и просушите в духовке при температуре 80 градусов Цельсия в течение 20 минут.

Накройте внутреннее дно чашки Петри парапленочной лентой, чтобы защитные стекла не скользили внутрь чашки Петри. Затем поместите покрытые аминами покровные стекла функциональной стороной с зондами натяжения ДНК вверх. Накройте покровные стекла при температуре минус 20 градусов Цельсия для дальнейшего использования.

Чтобы изменить аминные группы на покровных листах, добавьте липоевую кислоту-PEG-NHS и mPEG-NHS и инкубируйте чашку Петри при комнатной температуре в течение 1 часа. По окончании инкубации трижды промойте поверхность водой. После этого добавьте 100 микролитров 0,1 молярного бикарбоната натрия, содержащего 1 миллиграмм на миллилитр Sulfo-NHS-ацетата, в набор сэндвич-покровов и инкубируйте в течение 30 минут, чтобы произошла пассивация.

Добавьте 0,5 миллилитра наночастиц золота в каждую покровную крышку и выдержите 30 минут при комнатной температуре. После инкубации покровные стекла трижды промыть водой. После добавления гасителя черной дыры 2 нити в отожженный зонд натяжения ДНК в соотношении 10 к 1, добавьте 100 микролитров смеси на два покровных стекла, чтобы получился бутерброд.

Осторожно поместите влажный шарик из лабораторной салфетки в чашку Петри подальше от покровных стекол и заклейте чашку парапленочной лентой, чтобы раствор не высыхал. После этого накройте блюдо фольгой, и выдержите его при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день соберите камеру визуализации, стараясь не допустить растрескивания поверхности во время затяжки камеры. Затем добавьте от 0,5 до 1 миллилитра сбалансированного раствора соли Хэнка в камеру для визуализации.

Используйте канал Cy3B со 100-кратным объективом для захвата флуоресцентных сигналов клеток, нанесенных на зонды натяжения шпилек ДНК, когда они начинают распространяться. После приготовления 100 микромолярного нефлуоресцентного запирающего волокна, в желаемый момент времени, добавьте его в клетки в конечной концентрации 1 микромоль в камере визуализации для хранения сигнала натяжения и смешайте его с клетками с помощью пипетирования.

Примерно через 10 минут после блокировки получите покадровые видеоролики или конечные изображения в эпифлуоресцентном режиме для качественного отображения напряжения и количественного анализа.