JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 2:22 мин • July 8th, 2025
Начните со стеклянной чашки для визуализации, содержащей суспензию нейтрофилов человека — или иммунных клеток, и визуализируйте ее с помощью флуоресцентной системы визуализации.
Введите генетически модифицированные флуоресцентные конидии Aspergillus reporter conidia — или споры грибов, и делайте снимки через равные промежутки времени до 6 часов.
Споры грибов экспрессируют красные флуоресцентные белки и помечены снаружи неразлагаемыми пурпурными флуорофорами, что помогает отличать мертвые клетки от живых.
Во время инкубации нейтрофилы взаимодействуют с ассоциированными с патогенами молекулами на конидиях через рецепторы распознавания образов, способствуя их поглощению в фагосоме.
Позже фагосома сливается с ферментосодержащей лизосомой, образуя фаголизосому.
Внутри фаголизосомы активные формы кислорода и ферменты разрушают конидии.
Во время визуализации живых клеток, в начальный момент времени, интенсивная красная и пурпурная флуоресценция в фагосоме нейтрофилов указывает на присутствие живых конидий.
Со временем снижение красной флуоресценции с удержанием пурпурной флуоресценции свидетельствует о деградации конидий, подтверждая противогрибковую активность нейтрофилов.
Чтобы визуализировать DsRed и AlexaFlour 633 во время микроскопии, нагрейте нагреватель микроскопа и включите микроскоп и компьютер. Далее добавьте 100 микролитров 3 раза по 10 в 6-й на миллилитр конидиальной суспензии FLARE в соответствующие лунки чашки для визуализации. Запишите время добавления конидий FLARE.
Установите чашку для визуализации на предметный столик микроскопа. Затем в настройках съемки установите мощность лазера на 10% и время экспозиции на одну секунду, а также отрегулируйте чувствительность камеры для четкого, но не переэкспонированного изображения DsRed и AF 633, а также настройте список точек этапа. Инициализируйте визуализацию, когда все точки находятся в фокусе, флуоресцентные каналы оптимизированы, а время и продолжительность цикла заданы.