Анализ замедленного ингибирования роста для оценки действия антимикробных соединений, полученных из бактерий

Начните с агаровой тарелки, содержащей питательные вещества, и поместите в ее центр каплю ночной культуры первичных бактерий, продуцирующих ингибиторы.

Дайте культуре высохнуть, обеспечив минимальное распространение бактерий, и инкубируйте.

Отдельные бактерии образуют отдельные колонии и выделяют антимикробные соединения — молекулы-ингибиторы, которые диффундируют через агар на определенное расстояние.

Равномерно распылите разведенную культуру штамма бактерий-конкурентов на поверхность агара, содержащего колонии первичных бактерий.

Во время инкубации антимикробные соединения взаимодействуют с конкурирующими бактериями и нарушают их основные клеточные процессы.

Это приводит к гибели конкурирующих бактерий в этой конкретной области, вызывая значительное снижение роста бактерий.

В зоне, где нет антимикробных соединений, конкурирующие бактерии используют питательные вещества и образуют отдельные колонии.

Это создает дифференциальную модель роста с отчетливой зоной торможения. Определите диаметр этой зоны и прозрачность зоны, чтобы оценить действие антимикробных соединений, полученных из бактерий.

Чтобы приготовить бактериальные культуры в течение ночи, нанесите штаммы конкурентов и ингибиторов на стерильную агаровую пластину BHI и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия аэробно в течение примерно 18 часов. В 28-миллилитровую универсальную бутылку закиньте 10 миллилитров стерильного бульона BHI с одной колонией необходимого штамма бактерий-конкурентов.

Инкубируйте культуру в универсальном орбитальном вибростенде при температуре 37 градусов Цельсия и 250 об/мин в течение ночи. На следующий день убедитесь, что агаровые пластины полностью сухие без конденсата на крышке, чтобы предотвратить распространение инокуляции по пластине. Нанесите пипеткой 25 микролитров ночной культуры на центр агаровых пластин, избегая полного нажатия на поршень пипетки, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха, которые разбрызгивают культуру по агару.

Дайте культуре высохнуть при комнатной температуре, чтобы ограничить распространение культуры. Затем инкубируйте агаровые пластины при температуре 37 градусов Цельсия аэробно в течение ночи. После выращивания культуры в ночное время, работая под защитным шкафом уровня 2, обшитым абсорбирующей бумагой, используйте бульон BHI для разбавления культуры в десять раз, чтобы получить примерно 4 раза по 10 до шестого КОЕ на миллилитр. Затем перелейте разведенную культуру в стерильный пластиковый флакон для испарителя духов.

Чтобы провести анализ замедленного подавления роста, распылите культуру через каждую из бутылок испарителя, чтобы убедиться, что культура загружена в механизм распыления перед распылением на агар. С расстояния примерно 15 сантиметров над агаром распылите примерно 250 микролитров разведенной культуры по всей поверхности агара. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия аэробно в течение ночи.

Чтобы интерпретировать отложенное ингибирование роста, измерьте зону ингибирования роста распыляемого штамма-конкурента в миллиметрах, вычитая диаметр центрального пятна продуцента ингибитора. Наконец, запишите оценку ясности для зон торможения в соответствии с текстовым протоколом.