Клеточный анализ для идентификации агентов, взаимодействующих с CXCR4

Возьмите многолуночный планшет, покрытый желатином, содержащий прилипшие клетки рака мозга человека, экспрессирующие CXCR4.

Замените носитель на кальций-чувствительный краситель. Внутриклеточные эстеразы расщепляют краситель в непроницаемый для мембраны продукт, который связывается с ионами кальция, проявляя повышенную флуоресценцию.

Удалите краситель, промойте и добавьте буфер.

Поместите планшет в флуоресцентный считыватель микропланшетов с соединением, взаимодействующим с CXCR4 и содержащими хемокин CXCL12 планшетами.

Используя заданные автоматизированные параметры, закачивать в тестовые скважины увеличивающиеся концентрации компаундов, а затем удельную концентрацию CXCL12.

В контрольных лунках без компаунда CXCL12 связывается с CXCR4.

Это связывание активирует сигнальный каскад, высвобождая ионы кальция в цитоплазму, где они связывают краситель, усиливая флуоресценцию.

Однако в тестовых лунках взаимодействующие соединения ингибируют связывание CXCL12 с CXCR4, влияя на мобилизацию кальция и вызывая дозозависимое снижение флуоресценции, подтверждая их в качестве антагонистов CXCR4.

В день пропускания клеток покройте каждую лунку из 96-луночного полистирольного планшета с черными стенками и прозрачным дном 100 микролитрами 0,1% раствора желатина и инкубируйте пластины в течение двух часов при комнатной температуре. Пока желатин затвердевает, используйте раствор трипсина-ЭДТА, чтобы поднять интересующие клетки со дна их культуральной колбы, повторно суспендируя клетки в свежей питательной среде в конической трубке объемом 50 миллилитров после того, как они отделятся.

После подсчета соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в свежей питательной среде до концентрации 1 x 10⁵ жизнеспособных клеток на миллилитр. Когда пластины будут готовы, выбросьте излишки желатинового раствора и высушите пластины на лабораторной салфетке. Затем промойте лунки 200 микролитрами PBS и замените промывку 200 микролитрами клеток на лунку, для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе.

На следующее утро постучите по тарелке, чтобы сбросить питательную среду из лунок, и высушите тарелку вверх дном на бумажном полотенце. Затем пометьте клетки в каждой лунке 100 микролитрами раствора красителя на лунку и инкубируйте планшет в течение 45 минут в темноте при комнатной температуре. Пока клетки инкубируются, добавьте 75 микролитров CXCL12 на лунку в хемокиновую пластину и 50 микролитров интересующего соединения в каждую лунку компаундной пластины.

Затем включите блок охлаждения считывателя флуоресцентных пластин, а затем и сам считыватель пластин. Дав системе несколько минут на запуск, откройте программное обеспечение для считывания пластин. Чтобы настроить протокол анализа, на вкладке «Настройки» выберите «Режим чтения» и соответствующую длину волны возбуждения и излучения для загружающего красителя.

Выберите вкладку «Смешивание с передаточной жидкостью» для автоматического смешивания составов в компаундной пластине. На вкладке «Перенос жидкости» установите по 20 микролитров каждой лунки из составной пластины, которую нужно передать, в измерительную пластину и расположите наконечники пипеток на 20 микролитров ниже поверхности жидкости. Установите скорость аспирации на 50 микролитров в секунду, а скорость дозирования на 25 микролитров в секунду и нажмите «Читать с помощью передаточной жидкости».

В течение первого интервала выберите 60 считываний с интервалом считывания в одну секунду, при этом 10 считываний должны быть записаны до того, как соединения будут выданы на измерительную пластину, и 50 прочтений, которые должны быть завершены после. Установите второй интервал с интервалом чтения 30 секунд и 18 чтениями. Выберите три промывки наконечником для протокола, настроив каждый этап промывки так, чтобы он включал соответствующую жидкость для промывки, один цикл стирки, высокую скорость насоса и пять ходов за промывку.

Используйте функцию «Пауза Пипеттор», чтобы включить паузу пипеттора в 300 секунд, и используйте настройку «Смешивание с передаточной жидкостью», чтобы разрешить автоматическое смешивание раствора CXCL12 в хемокиновой пластине. На следующей вкладке «Перенос жидкости» установите 25 микролитров из каждой лунки хемокиновой пластины, которая должна быть перенесена на измерительную пластину, и расположите наконечники на 20 микролитров ниже поверхности жидкости. Установите скорость аспирации на 50 микролитров в секунду, а скорость дозирования на 25 микролитров в секунду.

С помощью кнопки "Чтение с помощью передаточной жидкости" установите первый интервал, включающий 145 операций чтения с интервалом чтения в одну секунду. Установите второй интервал на время интервала чтения в шесть секунд и 20 операций чтения. Выберите еще три цикла стирки наконечников, затем нажмите «Установить температуру этапа» и установите температуру устройства на 37 градусов по Цельсию.

В конце инкубации загрузочного красителя выбросьте буфер с измерительной пластины и высушите планшет на лабораторной салфетке. Промойте клетки 150 микролитрами на лунку буфера для анализа, заменив буфер на 80 микролитров буфера для анализа через две минуты. Поместите измерительную пластину в положение считывания, составную пластину в положение источника 2, хемокиновую пластину в положение источника 3 и коробку с черными наконечниками в положение источника 1.

Закройте устройство и нажмите «Тест сигнала протокола», чтобы определить фон, относительные световые единицы и варианты флуоресценции над пластиной. Выберите «Тест «Сигнал» во всплывающем окне. Если получены фоновые значения от 8 000 до 10 000 относительных световых единиц, выберите «Обновить» и нажмите «Сохранить», чтобы сохранить основной протокол.