Измерение in vitro активности фермента α-галактозидазы А и кислой α-глюкозидазы

α-галактозидаза А и кислота α-глюкозидаза являются лизосомальными ферментами, имеющими решающее значение для клеточного метаболизма.

α-галактозидаза А расщепляет субстраты, такие как гликолипиды, в то время как кислота α-глюкозидаза гидролизует гликоген.

Чтобы измерить их ферментативную активность in vitro, берут многолуночные лунки с образцами, содержащими известные концентрации α-галактозидазы А и кислоты α-глюкозидазы соответственно.

Добавьте в лунки необходимый объем кислотных растворов синтетических 4-метилумбеллифериловых субстратов, специфических флюорогенных субстратов, предназначенных для имитации природных субстратов для этих ферментов.

Инкубируйте в темноте.

α-галактозидаза А и ферменты кислой α-глюкозидазы расщепляют соответствующие субстраты, высвобождая флуоресцентный продукт, 4-метилумбеллиферон.

Добавьте щелочной буфер, чтобы завершить ферментативную реакцию.

С помощью флуоресцентного считывателя микропланшетов измерьте интенсивность флуоресценции 4-метилумбеллиферона в лунках, указывающую на его концентрацию, чтобы определить активность фермента α-галактозидазы А и кислоты α-глюкозидазы соответственно.

Разведите рассчитанное количество каждого образца и разбавьте е