Оценка эффективности тестируемого противовирусного соединения с помощью анализа на вирусную инактивацию

Возьмите пробирки с рекомбинантным вирусом гепатита С или суспензией ВГС, содержащей РНК, кодирующую секретируемый репортер люциферазы.

Добавьте противовирусное тестовое соединение и растворитель в тестовую и отрицательную контрольные пробирки.

Исследуемые соединения связываются с гликопротеинами ВГС, инактивируя вирус.

После инкубации разбавляйте смеси, чтобы предотвратить взаимодействие соединения с клетками на последующих этапах.

Добавьте эти разведенные смеси на монослои гепатомы, поддерживающие HCV-репликацию. Инкубировать.

Инактивированный соединением HCV не может прикрепляться к специфическим рецепторам клеточной поверхности, в то время как активные гликопротеины HCV связываются с этими рецепторами, облегчая клеточное прикрепление.

Удалите неадсорбированные вирусы гепатита С. Промойте буфером и добавьте фильтрующий материал. Инкубируйте в течение длительного времени.

Связанный HCV интернализуется, высвобождая вирусную РНК и приводя к синтезу вирусного белка и люциферазы, секретируемых клеткой.

Соберите люциферазосодержащие надосадочные жидкости культуры. Центрифугируйте и добавьте к надосадочной жидкости субстрат люциферазы.

Люцифераза окисляет подложку, излучая свет.

Более высокая люминесценция в контрольной лунке, чем в тесте, указывает на инактивацию вируса соединением.

Чтобы начать анализ вирусной инактивации, сначала нанесите 1 умножение на 10 до 4 клеток на лунку в 96-луночном планшете. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение ночи для прикрепления. Для заражения подготовьте вирус гепатита С или частицы ВГС, помеченные репортером Gaussia luciferase, как указано в текстовом протоколе.

В стерильной пробирке смешать 100 микролитров 100 микромолярных CHLA или PUG со 100 микролитрами 10 до четвертой фокусобразующих единиц или FFU HCV. Для положительного контроля смешайте HCV с гепарином в конечной концентрации 1000 микрограммов на миллилитр. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов.

Через три часа разведите смесь вирусного соединения в 50 раз с 9,8 миллилитрами базальной среды комнатной температуры. Затем приготовьте новую смесь соединений вируса и немедленно разведите эту смесь в базальной среде для образца инкубации нулевого часа. После удаления инкубационной среды из клеток добавьте 100 микролитров разведенного раствора вирусного препарата на лунку в трех экземплярах.

Теперь раствор содержит от 10 до второго БОЕ на лунку. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение трех часов, чтобы предотвратить вирусную инфекцию клеток. После инкубации удалите вирусную суспензию из лунок и аккуратно промойте клетки 200 микролитрами PBS дважды.

Инкубируйте клетки в 100 микролитрах базальной среды в течение 72 часов для репликации вируса и высвобождения люциферазного репортера в надосадочную жидкость. Затем соберите надосадочную жидкость из культур в микропробирки и центрифугируйте при 17 000 умноженных на g в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Смешайте по 20 микролитров каждой надосадочной жидкости с 50 микролитрами реактива для анализа гауссии люциферазы и измерьте люминесценцию от репортерной активности люциферазы в люминометре.