Колориметрическое определение бактериального биомаркера с помощью модифицированного лакмусового теста

Начните с ДНКфермента, расщепляющей РНК, каталитической ДНК, которая при связывании с определенным бактериальным биомаркером активируется.

ДНКфермент связан с магнитным шариком, покрытым стрептавидином, через биотин на его 5'-конце. На 3'-конце он связан с олигонуклеотид-связанной уреазой, образуя функциональную магнитную бусину.

В пробирку, содержащую функциональные магнитные шарики, добавьте лизат кишечной палочки.

Специфический биомаркер E. coli из лизата активирует ДНКфермент, вызывая расщепление связи РНК, вызывая отслоение конъюгата ДНК-уреаза.

С помощью магнитной подставки обездвижите шарики и удалите связанный с шариками конъюгат ДНКфермент-уреаза.

Перенесите высвободившуюся уреазу-содержащую надосадочную жидкость в другую пробирку.

Добавьте краситель для индикатора pH — феноловый красный, и раствор мочевины.

Уреаза гидролизует мочевину до аммиака и углекислого газа.

Аммиак, слабое основание, повышает pH раствора, вызывая изменение цвета, что указывает на наличие биомаркера кишечной палочки.

После подготовки клеток E. coli по текстовому протоколу предварительно промойте 1,5-миллилитровую микрофужерную пробирку, добавив и вортексировав 100 микролитров RB. Затем выбросьте буфер.

Добавьте 15 микролитров собранного ЕС1 в промытую трубку, затем поместите трубку на магнитный штатив и отасуньте надосадочную жидкость. Снимите трубку со штатива, добавьте 100 микролитров RB и осторожно снова суспензируйте магнитные шарики.

После использования RB для промывки бусин еще два раза и удаления RB добавьте в пробирку 10 микролитров образца кишечной палочки, и аккуратно перемешайте содержимое, постукивая по пробирке. Затем инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение одного часа.

После инкубации добавьте 90 микролитров дважды дистиллированной воды и поместите пробирку на магнитную решетку. Примерно через три минуты магнитной сепарации осторожно перенесите 85 микролитров надосадочной жидкости в микрофужную пробирку объемом 0,5 миллилитра.

Очень важно осторожно пипетировать раствор, не захватывая магнитные шарики. Эти бусины наполнены уреазой и будут генерировать ложноположительный сигнал.

Добавьте 15 микролитров 0,04% фенола красного и 100 микролитров раствора субстрата. Затем сделайте фотографии через определенные промежутки времени, чтобы зафиксировать изменение цвета.