Репортерный анализ люциферазы для изучения регуляции трансляции в клетках, инфицированных поксвирусом

Возьмем, к примеру, трансфекционные комплексы, содержащие репортерные мРНК, кодирующие люциферазу светлячков, или Fluc, и Renilla luciferase, или Rluc.

МРНК Fluc содержит 5'-полиаденозиновую последовательность, или поли(А)-лидер, в то время как мРНК Rluc лишена этой последовательности.

Трансфектировать неинфицированные и инфицированные поксвирусом клетки млекопитающих для доставки репортерных мРНК и инкубации.

В неинфицированных клетках эукариотические факторы инициации связываются с 5'-колпачком мРНК, после чего происходит рекрутирование малой рибосомной субъединицы и инициирующей тРНК.

После того, как малая субъединица располагает стартовый кодон, большая субъединица присоединяется для синтеза белков люциферазы.

В инфицированных клетках опосредованное поксвирусом фосфорилирование малой субъединицы вызывает сборку рибосом непосредственно на лидерной последовательности, усиливая выработку Fluc.

Лизируйте клетки для высвобождения люцифераз.

Добавьте субстрат Fluc, который фермент окисляет, излучая свет. С помощью считывателя пластин измерьте люминесценцию.

Повторите этот шаг для Rluc, чтобы определить относительное увеличение люминесценции Fluc по сравнению с Rluc в клетках, инфицир