Анализ влияния жесткости внеклеточного матрикса на бактериальную инфекцию

Возьмите лунки, содержащие полиакриламидные гидрогели различной жесткости, покрытые коллагеном, имитирующие физиологический внеклеточный матрикс, или ЭКМ.

Добавьте микрососудистые эндотелиальные клетки, которые образуют фокальные спайки, или FA — комплексы, опосредующие связывание клетки с ECM, — чтобы почувствовать жесткость гидрогеля.

Более жесткие гидрогели повышают экспрессию виментина, компонента цитоскелета, на клеточной поверхности по сравнению с более мягкими гидрогелями.

Добавьте бактерии Listeria monocytogenes, сконструированные для экспрессии флуоресцентного белка под промотором белка, индуцирующего сборку актина, или ActA.

Центрифуга для синхронизации контакта бактерий с клетками-хозяевами и инкубация.

Бактерии связываются с виментином. Большее количество виментина на более жестких гидрогелевых клетках хозяина приводит к большей адгезии бактерий и эндоцитозу.

Добавьте антибиотик, устраняя неинтернализованные бактерии.

Интернализованные бактерии выделяют токсины, разрывая мембрану эндосома. Цитоплазматический побег активирует промотор ActA для экспрессии флуоресцентного белка, мечения внутриклеточных бактерий.

Ферментативно отделите клетки. С помощью проточной цитометрии можно обнаружить более высокую флуоресценцию в клетках-хозяевах, расположенных на более жестких гидрогелях, что указывает на большую интернализацию бактерий.

После приготовления в течение ночи культуры L. monocytogenes в соответствии с текстовым протоколом переведите 1 миллилитр культуры в микроцентрифужную пробирку и уменьшите ее при 2000-кратном избытке и комнатной температуре в течение 4 минут. После использования PBS для тканевой культуры для двукратной промывки гранулы используйте 1 миллилитр PBS для ресуспендирования гранулы.

Приготовьте инфекционную смесь, смешав 10 или 50 микролитров бактериальной суспензии с 1 миллилитром полной среды MCDB-131 для получения множественности инфекции, или MOI, примерно 50 бактерий на клетку-хозяина или 10 бактерий на клетку-хозяина. Удалите среду из лунок 24-луночных планшетов, стараясь не нарушить гидрогели или клетки. Используйте 1 миллилитр полной среды MCDB-131, чтобы промыть клетки один раз, затем добавьте по 1 миллилитру бактерий в каждую лунку.

Накройте тарелки крышкой, и оберните их полиэтиленовой пищевой пленкой, чтобы избежать протекания. Центрифугируйте планшеты при 2 000 раз больше g в течение 10 минут, чтобы синхронизировать вторжение. Затем инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. С помощью полной среды MCDB-131 промыть образцы 4 раза и вернуть их в инкубатор для тканевых культур. Еще через 30 минут замените среду на полноценную среду MCDB-131 с добавлением 20 мкг гентамицина на миллилитр.

Чтобы провести проточную цитометрию через восемь часов после заражения, удалите среду из лунок 24-луночного планшета и используйте культуру тканей PBS для промывания лунок один раз. После удаления PBS добавьте по 200 микролитров смеси трипсин-ЭДТА-коллагеназы в каждую лунку. Поместите чашку в инкубатор для тканевых культур на 10 минут, чтобы обеспечить полную отслойку клеток.

После осторожного пипетирования в каждую лунку восемь раз добавьте 200 микролитров полной среды, чтобы нейтрализовать трипсин. Перелейте 400 микролитров клеточного раствора из каждой лунки в 5-миллилитровую полистирольную пробирку с крышкой клеточного фильтра 35 микрометров. Проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии.