Количественная покадровая микроскопия для оценки бактериальной диссеминации, зависящей от жесткости внеклеточного матрикса

Возьмите многолуночный планшет с адгезивными монослоями эндотелиальных клеток человека на покрытых коллагеном полиакриламидных гидрогелях различной жесткости.

Клетки на более жестких гидрогелях претерпевают значительную реорганизацию цитоскелета, увеличивая внутриклеточное давление, по сравнению с более мягкими гидрогелями.

Промойте клетки средой и добавьте сконструированные Listeria monocytogenes, экспрессирующие флуоресцентный белок под промотором белка, индуцирующего сборку актина (ActA).

Центрифуга для облегчения контакта клеток и бактерий. Инкубация для опосредования бактериального эндоцитоза.

Умывайтесь с помощью фильтрующего материала. Обработайте гентамицином для уничтожения неинтернализованных бактерий. Инкубировать.

Интернализованные бактерии выделяют порообразующие токсины, разрушая фагосомные мембраны. Цитозольные бактерии повышают экспрессию ActA и флуоресцентных белков, мечая внутриклеточные бактерии.

Белки ActA индуцируют полимеризацию актина, образуя хвост актиновой кометы, продвигающий бактерии вперед, вызывающий интернализацию соседними клетками и способствующий распространению.

После инкубации используйте красители-содержащие среды для окрашивания ядра клеток. Замените носители на среды, содержащие гентамицин.

Проведите покадровую микроскопию.

Более мягкие гидрогели способствуют быстрому межклеточному распространению бактерий по сравнению с более жесткими гидрогелями с повышенным внутриклеточным напряжением, что предполагает распространение бактерий, зависящее от жесткости матрицы.

После приготовления в течение ночи культуры L. monocytogenes в соответствии с текстовым протоколом переведите 1 миллилитр культуры в микроцентрифужную пробирку и уменьшите ее при 2000-кратном избытке и комнатной температуре в течение 4 минут. После использования PBS для тканевой культуры для двукратной промывки гранулы используйте 1 миллилитр PBS для ресуспендирования гранулы.

Приготовьте инфекционную смесь, смешав 10 или 50 микролитров бактериальной суспензии с 1 миллилитром полной среды MCDB-131 для получения множественности инфекции, или MOI, примерно 50 бактерий на клетку-хозяина или 10 бактерий на клетку-хозяина. Удалите среду из лунок 24-луночных планшетов, стараясь не нарушить гидрогели или клетки.

Используйте 1 миллилитр полной среды MCDB-131 для промывки клеток один раз, затем добавьте по 1 миллилитру бактерий в каждую лунку. Накройте тарелки крышкой, и оберните их полиэтиленовой пищевой пленкой, чтобы избежать протекания. Центрифугируйте планшеты при давлении 2000 x g в течение 10 минут, чтобы синхронизировать вторжение. Затем инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. С помощью полной среды MCDB-131 промыть образцы 4 раза и вернуть их в инкубатор для тканевых культур. Еще через 30 минут замените среду на полноценную среду MCDB-131 с добавлением 20 мкг гентамицина на миллилитр.

После посева клеток HMEC-1 на гидрогели PA и обработки гентамицином в соответствии с текстовым протоколом инкубируйте планшет в течение пяти часов, чтобы промотор ActA включился и управлял экспрессией открытой рамки считывания mTagRFP.

Через четыре часа после заражения смешайте 1 микролитр красителя Hoechst 1 мг/мл с 1 миллилитром полной среды L15 и добавьте его в каждую лунку, чтобы окрашивать ядра. После инкубации клеток в течение 10 минут замените среду 1 миллилитром полной среды L15 с добавлением 20 мкг на миллилитр гентамицина.

Визуализируйте несколько положений каждые 5 минут с помощью функции автофокусировки для отслеживания того, как LM-бактерии распространяются через монослои HMEC-1, засеянные гидрогелями различной жесткости.