Количественная покадровая микроскопия для оценки бактериальной диссеминации, зависящей от жесткости внеклеточного матрикса

Возьмите многолуночный планшет с адгезивными монослоями эндотелиальных клеток человека на покрытых коллагеном полиакриламидных гидрогелях различной жесткости.

Клетки на более жестких гидрогелях претерпевают значительную реорганизацию цитоскелета, увеличивая внутриклеточное давление, по сравнению с более мягкими гидрогелями.

Промойте клетки средой и добавьте сконструированные Listeria monocytogenes, экспрессирующие флуоресцентный белок под промотором белка, индуцирующего сборку актина (ActA).

Центрифуга для облегчения контакта клеток и бактерий. Инкубация для опосредования бактериального эндоцитоза.

Умывайтесь с помощью фильтрующего материала. Обработайте гентамицином для уничтожения неинтернализованных бактерий. Инкубировать.

Интернализованные бактерии выделяют порообразующие токсины, разрушая фагосомные мембраны. Цитозольные бактерии повышают экспрессию ActA и флуоресцентных белков, мечая внутриклеточные бактерии.

Белки ActA индуцируют полимеризацию актина, образуя хвост актиновой кометы, продвигающий бактерии вперед, вызывающий интернализацию соседними клетками и способствующий распространению.

После инкубации используйте красители-содержащие среды для окрашивания ядра клеток. За