Определение противовирусной эффективности экспериментальных препаратов с помощью анализа бляшек

Начните с вируссодержащего образца, полученного из инфицированной роговицы свиньи, обработанной противовирусным препаратом.

Выполните последовательное разведение образца для создания последовательности снижения концентраций вируса.

Оптимальное разведение предотвращает заражение одной клетки несколькими вирусами.

Введите разведенные образцы в монослой клетки-хозяина и инкубируйте.

Вирус прикрепляется к рецептору клетки-хозяина, проникает в клетку и инициирует ее репликацию. Инфицированная клетка лизируется, высвобождая вирионы.

Добавьте метилцеллюлозу, вязкое вещество, которое ограничивает вирусы соседними клетками.

Впоследствии вирусы вызывают гибель клеток и образование бляшек в инфицированной области.

Добавьте метанол для фиксации клеток.

Используйте кристаллический фиолетовый цвет для окрашивания живых клеток.

Наблюдайте за бляшками в виде четких зон, указывающих на инфицированные клетки и гибель клеток, окруженных неинфицированными клетками, окрашенными в кристаллический фиолетовый цвет.

Наконец, подсчитайте количество бляшек при наибольшем разведении для количественной оценки титра вируса в исходном растворе для определения эффективности противовирусного препарата.

Чтобы количественно оценить количество вируса, собранного из каждой роговицы, приготовьте log₁₀ однократного разведения вируса в бессывороточной среде в микроцентрифужных пробирках до тех пор, пока не будет достигнуто разведение 1 x ^10-8.

После аспирации питательной среды из каждой лунки клеток перенесите по 1 миллилитру каждого разведения вируса, начиная с 1 х ^10-3 на покрытые монослои клеток, и поместите инфицированные клетки в инкубатор для клеточных культур на два часа. В конце инкубации аккуратно промойте каждую лунку 2 раза PBS, прежде чем добавить 2 миллилитра среды, насыщенной метилцеллюлозой, в каждую лунку в течение 72-часовой инкубации или до тех пор, пока не будет наблюдаться образование бляшек.

После осмотра зубного налета медленно добавьте 1 миллилитр метанола в угол каждой лунки для 15-минутной инкубации при комнатной температуре. По окончании инкубации медленно отсасывайте содержимое из каждой лунки, не нарушая монослой клеток.

Затем пометьте каждую лунку 1 миллилитром кристаллического фиолетового рабочего раствора, следя за тем, чтобы все клетки были покрыты на 30-минутную инкубацию в защищенном от света месте. По окончании инкубации выбросьте раствор и просушите лунки на листе абсорбирующей бумаги. Затем подсчитайте количество бляшек в самой высокой лунке разведения, чтобы количественно определить общее содержание вируса в исходном растворе 3 раза.