Анализ для определения инициации полимикробной биопленки на инфицированных вирусом клетках

Возьмите многолуночный планшет, содержащий монослои клеток млекопитающих.

Затравите лунки с вирусом простого герпеса. В контрольных колодцах вирус отсутствует.

Вирус прикрепляется к гепарансульфату на клеточной поверхности и интернализуется через эндоцитоз.

Вирусная инфекция запускает секрецию гепараназы, которая расщепляет сульфат гепарана и демаскирует специфические грибковые рецепторы.

Совместно инкубируйте клетки с зародышевыми трубками Staphylococcus aureus и Candida albicans.

В инфицированных вирусом клетках истощение гепарансульфата ингибирует бактериальное взаимодействие, способствуя взаимодействию грибковых рецепторов, предотвращая бактериально-грибковую колокализацию.

В контрольных клетках бактерии взаимодействуют с сульфатом гепарана, в то время как грибы связываются с имеющимися рецепторами.

Эта микробная колокализация инициирует адгезию — первый шаг в образовании биопленки.

После инкубации удалите несвязанные микробы. Покрыть буфером для лизиса, выпустив бактерии и грибки в среду.

Распределите лизат клеток на планшетах, содержащих питательную среду. Инкубация для образования колонии.

Уменьшение колоний бактерий при соответствующем увеличении колоний грибов указывает на индуцированное вирусом ингибирование бактериально-грибковой колокализации и инициации биопленки.

Для проведения полимикробного биопленочного анализа засеивают 96-луночные планшеты с 200 микролитрами 2 умножить на 10 до 5-го количества клеток HeLa на миллилитр. Покачивайте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30–45 минут, а затем инкубируйте в 5% углекислом газе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18 часов. Используйте 1x оптимально для стирки монослоев. Затем засейте одним штаммом ВПГ. Тестируйте только один штамм за раз.

Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение трех часов. Используя 100 микролитров 37 градусов Цельсия PBS с магнием и кальцием, промойте зараженные монослои. Затем используйте HBSS с температурой 37 градусов Цельсия для замены PBS. Оставьте по 25 микролитров HBSS в каждой лунке.

Затем добавьте рабочие суспензии GT и/или S. aureus и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение 30 минут. После инкубации отсасывайте по одному столбцу планшета за раз. Немедленно наполните лунки, используя 300 микролитров PBS с магнием и кальцием.

Повторив этот этап промывки дважды, добавьте 200 микролитров в разведении от 1 до 50 стерилизованного фильтром буфера для лизиса RIPA в каждую лунку.

При работе с другими штаммами бактерий или грибов убедитесь, что используемая концентрация RIPA достаточна для лизиса клеток, но все же допускает для тестирования жизнеспособности микроорганизмов.

Быстро растирайте лизат клеток HeLa и пипетируйте 50 микролитров на соли маннитола и/или фунгицидную среду. Затем с помощью стеклянного стержня, согнутого под углом 90 градусов, распределите лизат по поверхности пластины.

После инкубации планшетов в течение 18 часов вручную подсчитайте количество колоний на одной пластине. Контрольная группа состоит из S. aureus и/или C. albicans, прилипших к неинфицированным ВПГ клеткам HeLa.