Анализ использования АТФ для определения выживаемости бактерий при лечении антибиотиками

Начните с посева бактериальной культуры в планшет для анализа. Затем инкубируйте тарелку.

Бактериальные клетки имеют поверхностные адгезины и пили, которые позволяют им прилипать друг к другу, образуя небольшие агрегаты.

Добавьте в лунки антибиотики различной концентрации, оставив одну из них необработанной для контроля.

Молекулы антибиотика взаимодействуют с чувствительными бактериями, влияя на их способность расти и размножаться, что приводит к их гибели.

Устойчивые к антибиотикам бактерии остаются метаболически активными, продуцируя молекулы АТФ.

Используйте ультразвуковую терапию для разрушения бактериальных клеток, высвобождая их внутриклеточное содержимое, в том числе АТФ.

Добавьте АТФ-утилизационный реагент свечения, содержащий люциферин, фермент люциферазу и другие кофакторы.

Люцифераза использует АТФ и кислород для превращения люциферина в возбужденный оксилюциферин.

Впоследствии оксилюциферин переходит в основное состояние, излучая люминесцентный свет.

Измерьте поглощение с помощью считывателя пластин.

Снижение абсорбции при более высоких концентрациях антибиотиков предполагает более низкую продукцию АТФ, что указывает на снижение выживаемости бактерий.

Измерьте оптическую плотность на 650 нанометрах или наружном диаметре₆₅₀, чтобы определить концентрацию взвешенных бактерий, и отрегулируйте концентрацию GC примерно до 1 x 10⁸ колониеобразующих единиц на миллилитр. Затем добавьте 99 микролитров суспензии GC в отдельные лунки 96-луночного планшета и дайте бактериям накапливаться при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 6 часов.

В конце инкубации добавьте по 1 микролитру серийно разведенного цефтриаксона в каждую лунку, оставив некоторые лунки необработанными для использования в качестве контрольных, и верните тарелку в инкубатор еще на 24 часа. На следующий день проведите ультразвуковую обработку суспензии в каждой лунке три раза по 144 Вт и 20 килогерц в течение 5 секунд на каждую лунку и добавьте в каждую лунку 100 микролитров коммерчески доступного реагента для использования АТФ.

Осторожно переложите 150 микролитров смеси из каждой лунки в отдельные лунки нового 96-луночного черного микропланшета и измерьте поглощение каждой лунки на 560 нанометрах на планшетном ридоре. Затем рассчитывают выживаемость по отношению показаний, полученных после серийного лечения антибиотиками, к показаниям из необработанных лунок.