Определение роли нейтрофилоподобных клеток в чувствительности клеток лимфомы к тестируемому препарату

Возьмем многолуночный планшет, содержащий 3D-сфероидные монокультуры клеток лимфомы, раковых лейкоцитов и кокультур лимфомы и нейтрофильных клеток в матриксе базальной мембраны.

Добавьте тестовый препарат, который связывается с внутриклеточным тубулином и нарушает полимеризацию микротрубочек, в результате чего происходит клеточный апоптоз.

В кокультуре прямой контакт клеток лимфомы активирует нейтрофилоподобные клетки, индуцируя секрецию цитокинов.

Эти цитокины взаимодействуют с рецепторами клеток лимфомы, запуская нисходящие сигнальные каскады и повышая экспрессию антиапоптотических белков, способствуя выживанию клеток.

Выбросьте носители. Добавьте буфер диссоциации, чтобы нарушить клеточную адгезию.

Соскребите сфероиды и высиживайте их под перемешиванием. Переложите суспензию в пробирки и продолжайте перемешивание до образования одноклеточных суспензий.

Введите коктейль флуорофор-конъюгированных антител, который маркирует лимфому и нейтрофилоподобные клетки.

Добавьте меченный флуорофором аннексин V и йодид пропидия для маркировки апоптотических и мертвых клеток.

С помощью проточной цитометрии можно обнаружить повышенную выживаемость клеток лимфомы в кокультуре, что указывает на нейтрофил-опосредованную защиту от препарата.

Чтобы создать 3D-кокультуру, добавьте 50 000 В-клеток лимфомы RL в одиночку или смешайте с HL60-дифференцированными клетками в стерильных 15-миллилитровых пробирках.

Раскрутите образцы и повторно суспендируйте гранулы в 300 микролитрах матрицы базальной мембраны с помощью наконечника пипетки объемом 1 миллилитр с отверстием, срезанным до 2-3 миллиметров. Затем инкубируйте по 300 микролитров клеток в каждой лунке 24-луночного планшета в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

По окончании инкубации добавьте по 1 миллилитру полной среды RPMI в каждую лунку и возвращайте в инкубатор 3D-культуры еще на семь дней с подменой среды каждые два дня. На 5 день добавьте в культуры 10 наномоляров винкристина.

После одной недели культивирования аспирируйте среду и промойте каждую лунку 2 раза 1 миллилитром ледяного PBS. Затем добавьте 3 миллилитра ледяного PBS с ЭДТА в каждую лунку и соскребите дно лунок наконечником пипетки объемом 200 микролитров, чтобы отделить гели. Аккуратно встряхните тарелку на льду в течение 30 минут. Затем переложите клеточные суспензии в отдельные стерильные 15-миллилитровые пробирки для легкого встряхивания на льду еще 30 минут.

Подтвердите появление гомогенной клеточной суспензии. Затем раскрутите ячейки вниз, а затем промойте PBS и повторно суспендируйте гранулы в свежих PBS с FBS. Наконец, пометьте клетки соответствующими антителами и красителями для обеспечения жизнеспособности, как показано выше, и проанализируйте RL и HL60-дифференцированные клетки с помощью проточной цитометрии с использованием проиллюстрированной стратегии гейтирования.