Почему изоляция CD14+ моноцитов имеет значение для валидации мишени?

Изоляция CD14+ моноцитов позволяет напрямую оценить индуцированную МСК иммуномодулирующую популяцию, ответственную за секрецию IL-10 и супрессию T-клеток, что способствует валидации механистической мишени.

Как разведение CFSE позволяет количественно определить зависимую переменную в данном анализе?

Разбавление CFSE позволяет измерить пролиферацию Т-клеток путем отслеживания снижения интенсивности флуоресценции в ходе делений, что обеспечивает количественную оценку супрессии в качестве зависимой переменной в экспериментах по совместному культивированию.

Какое количество повторностей необходимо для обеспечения надежности анализа между различными группами исследователей?

Для воспроизведения результатов между разными операторами и центрами необходима одинаковая продолжительность совместного культивирования MSC-PBMC, эффективность изоляции моноцитов и условия активации Т-клеток для получения воспроизводимых показателей супрессии.

Какой статистический анализ необходим для интерпретации эффектов концентрации моноцитов?

Анализ зависимости «доза-эффект» с использованием возрастающих концентраций моноцитов позволяет провести статистическое сравнение подавления пролиферации T-клеток, что обеспечивает количественную оценку иммуномодулирующей активности.

На каком этапе процесса поиска и разработки следует внедрять данный анализ?

Данный анализ следует применять после идентификации мишени MSC для подтверждения моноцитарного иммуномодулирующего механизма перед переходом к оптимизации ведущего соединения или доклиническим исследованиям эффективности.

Анализ in vitro для оценки иммуномодулирующего влияния моноцитов на пролиферацию лейкоцитов

JoVE Encyclopedia of Experiments

Иммунология

0 просмотров • 2:46 мин • July 8th, 2025

Возьмите многолуночный планшет с адгезивной культурой мезенхимальных стволовых клеток, или МСК.

Добавьте мононуклеарные клетки периферической крови, или PBMC, и инкубируйте.

МСК секретируют фактор роста гепатоцитов, побуждая моноциты приобретать иммуномодулирующий фенотип, продуцируя интерлейкин-10, или ИЛ-10.

Перенесите содержащую ПМК надосадочную жидкость в трубку.

Добавьте покрытые антителами магнитные шарики, связывающиеся с поверхностным маркером моноцитов CD14.

Используйте магнитный сепаратор для выделения моноцитов CD14+ и добавляйте их в лунки с несколькими лунками в возрастающих концентрациях.

Введите флуоресцентные эффекторные CD4+ Т-клетки, меченные CFSE.

Добавьте конъюгированные антителами микрогранулы, специфически связывающиеся с маркерами поверхности Т-клеток CD3 и CD28, активируя клетки.

В контрольной группе с хорошо отсутствующими моноцитами активируемые Т-клетки пролиферируют, при этом при каждом делении клетки снижается интенсивность флуоресценции CFSE в дочерних клетках.

Однако в кокультурах моноциты, индуцированные МСК, секретируют IL-10, подавляя пролиферацию эффекторных Т-клеток.

Используя проточную цитометрию, наблюдайте меньшее количество Т-клеток со сниженной интенсивностью флуоресценции CFSE с увеличением концентрации моноцитов, что указывает на подавление пролиферации эффекторных Т-клеток моноцитами, индуцированными МСК.

Чтобы провести анализ подавления эффекторов, начните с создания ко-культуры МСК-ПБМК с 2,5 x 10⁶ ПМЦ, совместно культивируемых с 250 000 МСК, чтобы обеспечить достаточное количество МСК совместно культивируемых МПК для отбора субпопуляций.

Через 48–72 часа при 37 градусах Цельсия выберите интересующие МСК иммуномодулирующие лейкоциты с помощью соответствующих магнитных шариков. Затем добавьте меченные CFSE аллогенные CD4-положительные Т-клетки в 1 миллилитр полной лейкоцитарной среды на лунку в различных экспериментальных соотношениях.

Затем добавьте анти-CD3/28-конъюгированные микрогранулы в соотношении 1:1 для стимуляции CD4-положительных Т-клеток. На третий день ко-культивирования оцените пролиферацию CD4-положительных Т-клеток, меченных CFSE, с помощью проточной цитометрии.