Исследование in vitro влияния стромальных клеток на рекрутирование лейкоцитов

Возьмем предварительно собранные проточные камеры, подключенные к проточным системам с фильтрами Transwell: одна с эндотелиальной монокультурой сверху, другая с эндотелиальной культурой сверху и стромальными клетками снизу.

Обе камеры предварительно обрабатываются провоспалительным цитокином.

В монокультуре цитокины активируют эндотелиальные клетки, повышая экспрессию молекул адгезии.

Тем не менее, перекрестное взаимодействие между стромальными и эндотелиальными клетками в кокультуре приводит к тому, что стромальные клетки вырабатывают регуляторные медиаторы, которые подавляют реакцию эндотелиальных клеток на провоспалительные цитокины.

Расположите камеру на инвертированном предметном столике фазово-контрастного микроскопа.

Введите суспензию нейтрофилов.

Нейтрофилы рекрутируются и связываются с молекулами эндотелиальной адгезии посредством транзиторных адгезивных взаимодействий, облегчая их взаимодействие с поверхностно связанными хемокинами и катясь вдоль эндотелия.

Это взаимодействие активирует интегрины на нейтрофилах, стабилизируя адгезию и приводя к трансмиграции через эндотелиальные клетки.

Однако в ко-культуре подавленный эндотелиальный ответ приводит к подавлению рекрутинга нейтрофилов.

Визуализируйте культуры с помощью фазово-контрастной микроскопии для оценки рекрутирования нейтрофилов из потока.

Для модели фильтра сначала отрежьте кусок парапленки до того же размера, что и стеклянная покровная крышка, используя металлический шаблон. Затем вырежьте в парафильме прорезь размером 20 на 4 миллиметра с помощью металлического шаблона, чтобы создать канал потока. С помощью прокладки Parafilm отметьте проточный канал на стекольной крышке. Совместите края шестилуночного фильтра по стеклозащитному колпачку. Убедитесь, что фильтр закрывает разметку проточного канала. Аккуратно вырежьте фильтр с помощью скальпеля типа 10А.

Затем тщательно накройте фильтр прокладкой Parafilm, следя за тем, чтобы проточный канал находился посередине фильтра. Используйте кусочек чистой салфетки и выдавите все пузырьки. Теперь поместите покровное стекло в углубление нижней пластины проточной камеры Perspex.

Расположите верхнюю пластину из плексигласа над верхней частью прокладки и завинтите пластины вместе. Поверните трехпозиционный кран, чтобы буфер промывки PBS-A прошел через клапан. Затем подсоедините трубку манометра к входному отверстию верхней пластины из плексигласа. Пропустите PBS-A через проточный канал, чтобы пропустить пузырьки.

Затем подсоедините трубку манометра от шприцевого насоса в выходное отверстие пластины Perspex. Очистите все PBS-A, которые капли на верхнюю пластину камеры. Наконец, поместите камеру на предметное столико инвертированного фазово-контрастного микроскопа и отрегулируйте фокус для визуализации эндотелиальных клеток над фильтрами.

Чтобы перфузировать лейкоциты над эндотелиальными клетками, установите насос шприца на повторное наполнение и нажмите Run. После того, как фокус будет скорректирован для визуализации монослоя эндотелиальных клеток, поместите два миллилитра очищенных нейтрофилов в резервуар для образца и оставьте в тепле на две минуты. Затем промойте эндотелий с помощью PBS-A в течение двух минут. Включите клапан, чтобы перфузировать нейтрофилы над эндотелием. Вводите болюс нейтрофилов в течение четырех минут. Выключите вентиль и отсоедините PBS-A от промывочного резервуара до конца эксперимента.

При проведении эксперимента следите за тем, чтобы пузырьки воздуха не проходили ни в одной точке во время анализа, так как это нарушит монослой эндотелиальных клеток и вызовет отслоение адгезивных нейтрофилов.

Регистрируйте рекрутирование нейтрофилов во время потока нейтрофилов или после перфузии с помощью программного обеспечения для цифрового захвата изображений. Определите центр канала, переместив объектив к краю канала на входном отверстии и определив середину порта. Все цифровые записи должны составлять не менее 5-10 полей в центре проточного канала.

Во время записи во время потока нейтрофилов делайте снимки одного поля каждые 10 секунд в течение одной минуты. Двигайтесь по каналу, и запишите еще одно поле в течение одной минуты, повторяя этот процесс в течение всего болюса.

Для регистрации постперфузии сделайте 10-секундную запись от 5 до 10 полей вниз по центру проточного канала для оценки поведения лейкоцитов. Делайте снимки каждую секунду с интервалом в 10 секунд. Это дает достаточно времени для анализа захвата из потока и поведения адгезивных нейтрофилов.

Записывайте одно поле, содержащее не менее 10 трансмигрировавших нейтрофилов, в течение пяти минут, делая снимки каждые 30 секунд. Это может быть использовано для расчета скорости мигрирующих клеток. Запишите еще одну серию 10-секундных полей. Это позволяет нейтрофилам мигрировать через эндотелиальный монослой.

Наконец, остановите шприцевой насос и снимите выпускную трубку, а затем входную трубку. Разберите проточную камеру и промойте резервуар для образца PBS-A. Повторите эти действия для последующих фильтров и микрослайд-каналов, прежде чем приступить к анализу набора и поведения лейкоцитов, как описано в текстовом протоколе.