Количественная оценка стареющих раковых клеток на основе проточной цитометрии

Принимайте раковые клетки, предварительно обработанные химиотерапевтическим препаратом, который вызывает старение в процентном соотношении клеток.

Эти клетки накапливают автофлуоресцентные гранулы липофуссина, известный маркер старения.

Добавьте антибиотик, который проникает в клетки и ингибирует лизосомальные протонные насосы, предотвращая лизосомальное закисление.

Повышение pH инактивирует лизосомальные ферменты.

Стареющие клетки сверхэкспрессируют лизосомальную β-галактозидазу даже при почти нейтральном pH, что делает ее биомаркером старения.

Введите субстрат с β-галактозидазой. Инкубировать.

β-галактозидаза гидролизует интернализованный субстрат в флуоресцентный продукт, помечая стареющие клетки.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте краситель для повышения жизнеспособности клеток. В живых клетках активные эстеразы превращают краситель в непроницаемый для мембраны флуоресцентный продукт. Мертвые клетки с нарушенной целостностью мембраны остаются неокрашенными.

С помощью проточной цитометрии можно обнаружить жизнеспособные клетки, демонстрирующие двойные маркеры липофусцин и флуоресцентный субстрат β-галактозидазы, указывающие на стареющие клетки.

Количественно оцените процент стареющих клеток, чтобы продемонстрировать эффективность препарата.

Сначала отрегулируют лизосомальный рН культивируемых образцов клеток, добавив в клеточную гранулу раствор одного микромолярного бафиломицина А в DMEM в концентрации один умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр, и перемешать пипеткой. Инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия на ротаторе на медленной скорости. Затем, чтобы окрашивать на бета-галактозидазу, связанную со старением, добавьте в образцы стоковый раствор DDAOG в концентрации 10 микрограммов на миллилитр без промывки.

Поместите на вращатель на 60 минут, защищенное от прямых солнечных лучей. Как и раньше, центрифугируйте пробирки. Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу одним миллилитром ледяного 0,5% BSA в PBS. Затем добавьте 300 микролитров разведенного раствора кальцина фиолетового 450 AM в промытые клеточные гранулы. Инкубировать в течение 15 минут на льду в темноте.

Перенесите образцы клеток в пробирки, совместимые с приборами проточной цитометрии. В программном обеспечении для сбора данных откройте гистограмму фиолетового канала и точечную диаграмму дальнего красного канала против зеленого канала. Начните сбор данных цитометра на низкой скорости забора и поместите положительные контрольные образцы, окрашенные DDAOG, на входной порт. Начните сбор образцов данных. Отрегулируйте напряжение канала таким образом, чтобы более 90 % событий содержалось в пределах каждого графика.

Когда все настройки оптимальны, запишите 10 000 событий на выборку. Поместите контрольные образцы только для автомобиля, окрашенные DDAOG, на впускное отверстие. Инициируйте сбор данных и записывайте 10 000 событий на образец. Обратите внимание на увеличение автофлуоресценции или сигнала ФП и галактозида DDAO по сравнению с положительным контролем. Сохраните образец данных в формате . Формат файла FCS и экспорт файлов на рабочую станцию компьютера, оснащенного программным обеспечением для анализа проточной цитометрии.