Количественная оценка стареющих раковых клеток на основе проточной цитометрии

Принимайте раковые клетки, предварительно обработанные химиотерапевтическим препаратом, который вызывает старение в процентном соотношении клеток.

Эти клетки накапливают автофлуоресцентные гранулы липофуссина, известный маркер старения.

Добавьте антибиотик, который проникает в клетки и ингибирует лизосомальные протонные насосы, предотвращая лизосомальное закисление.

Повышение pH инактивирует лизосомальные ферменты.

Стареющие клетки сверхэкспрессируют лизосомальную β-галактозидазу даже при почти нейтральном pH, что делает ее биомаркером старения.

Введите субстрат с β-галактозидазой. Инкубировать.

β-галактозидаза гидролизует интернализованный субстрат в флуоресцентный продукт, помечая стареющие клетки.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте краситель для повышения жизнеспособности клеток. В живых клетках активные эстеразы превращают краситель в непроницаемый для мембраны флуоресцентный продукт. Мертвые клетки с нарушенной целостностью мембраны остаются неокрашенными.

С помощью проточной цитометрии можно обнаружить жизнеспособные клетки, демонстрирующие двойные маркеры липофусцин и флуоресцентный субстрат β-галактозидазы, указывающие на стареющие клетки.

Количеств