$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмите многолуночный планшет с плоским дном и лунками, содержащими бактерии в питательных средах или бактерии в питательных средах с добавлением желчной соли.
Желчные соли вызывают стресс, вызывая повреждение клеток и высвобождая ДНК и белки. Эти биомолекулы покрывают дно скважин, позволяя выжившим бактериям прилипать к твердой поверхности.
Прикрепленные бактерии размножаются, образуя микроколонии и производя автоиндукторы — или химические сигнальные молекулы, обеспечивающие бактериальную коммуникацию.
Эта коммуникация заставляет бактерии колонизировать и инициировать производство внеклеточных полимерных веществ или EPS, создавая биопленку.
После инкубации удалите среду, чтобы устранить свободно плавающие бактерии.
Введите кристаллический фиолетовый краситель, который взаимодействует с пептидогликаном клеточной стенки бактерии, придавая ей фиолетовый цвет.
Удалите лишнее пятно и высушите. Обложите этанолом для растворения кристалла фиалки из клеточной стенки бактерии, изменяя цвет раствора.
Более интенсивная окраска в скважинах, обработанных желчными солями, чем в необработанных, подтверждает образование биопленки за счет адгезии к твердой фазе.
Сначала пометьте две 1,5-миллилитровые трубки как TSB и TSB плюс BS. Затем добавьте 1 миллилитр TSB или TSB плюс BS в соответствующие пробирки.
Далее инокулируйте в пробирки 20 микролитров ночной культуры в разведении 1:50. Затем добавьте по 130 микролитров неинокулированной контрольной среды в каждую из трех лунок в стерильной, прозрачной, обработанной культурой тканей с плоским дном, 96-луночной пластиной. Это будет пустой контроль.
Добавьте по 130 микролитров инокулированной культуры в каждую из трех лунок. После добавления контрольной и инокулированной культуры в соответствующие лунки инкубируйте 96-луночный планшет в течение 4–24 часов при температуре 37 градусов Цельсия статически. После завершения инкубации установите контрольную ячейку в пустое положение на считывателе планшетов.
Далее отсасывайте питательную среду из каждой лунки. Затем аккуратно промойте лунки один раз 200 микролитрами стерильного PBS. После промывки аспирируйте PBS, а затем переверните пластину для высыхания примерно на 20 минут.
Очень важно обеспечить бережное удаление фильтрующего материала и бережную промывку, чтобы не повредить матрицу из пенополистиры.
Далее добавьте по 150 микролитров 0,5% кристаллической фиалки в каждую из опытных и контрольных лунок. Затем выдержите тарелку в течение пяти минут при комнатной температуре. Через пять минут один раз промойте лунки 400 микролитрами дистиллированной воды. Добавьте 200 микролитров дистиллированной воды, чтобы промыть лунки пять раз. После всех пяти стирок переверните тарелку, и дайте ей полностью высохнуть, защищенной от света.
Для получения стабильных результатов важно, чтобы образцы были тщательно высушены, прежде чем продолжить.
После того как пластина полностью высохнет, используйте 200 микролитров 95% этанола для удаления пятен из лунок. Затем оставьте тарелку на шейкере на 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия во избежание испарения. Через 30 минут запишите внешний диаметр540 на считыватель пластин.