Метод пробоподготовки для визуализации биопленкообразующих бактерий на гифах грибов

Введите связанную с целлофаном колонию грибов в флуоресцентно меченую бактериальную суспензию. Достаньте целлофан и инкубируйте.

Бактериальные клетки прикрепляются к поверхности гриба через поверхностные молекулы и рецепторы. Адгезивные бактерии выделяют внеклеточные полимерные вещества, состоящие из полисахаридов, белков и ДНК, захватывая бактериальные клетки и формируя структурную основу биопленки.

Промойте секцию в крепком солевом растворе, чтобы удалить слабо связанные бактерии

В фосфатном буфере разрежьте часть колонии.

Перенесите срез в стерильную воду, содержащую агглютинин зародышей пшеницы, или WGA, связанную с красным флуоресцентным красителем.

WGA, растительный белок, связывается с остатками N-ацетилглюкозамина и сиаловой кислоты, позволяя прикрепленному красителю флуоресцировать на клеточной стенке гриба.

Промойте срез в фосфатном буфере.

Частично погрузите предметное стекло в буфер. Пусть секция плавает на ней. Осторожно поднимите, чтобы секция осела без разрушения биопленки.

Установите монтажный материал, а затем покровное стекло для микроскопического анализа.

После выращивания бактерий в течение ночи центрифугируйте культуру при 5000 г в течение трех минут, а затем суспензируйте гранулу в 25 миллилитрах стерильного 0,1 молярного калий-фосфатного буфера. После повторения центрифугирования с помощью того же буфера отрегулируйте конечную концентрацию бактерий до 10 до девяти клеток на миллилитр.

Заполните микропланшет на 6 лунок 5 миллилитрами бактериальной суспензии. С помощью стерильного бритвенного лезвия разрежьте целлофановую мембрану грибковой культуры на квадраты, с одной колонией на каждой мембране. Затем с помощью щипцов осторожно удалите из твердой среды целлофановые квадраты, содержащие гифы, и перенесите их в отдельные лунки бактериальной суспензии.

Осторожно встряхивайте микропластину до тех пор, пока колонии грибков не оторвутся от целлофана. Затем удалите листы целлофана, оставив колонии грибов в тарелке. Инкубируйте микропланшет с легким перемешиванием при температуре 20 градусов Цельсия в течение некоторого времени в зависимости от используемых штаммов и анализируемой стадии.

Для P. fluorescens BBc6/L. bicolor инкубируйте культуры в течение 30 минут, чтобы получить биопленки на ранних стадиях, и до 16 часов для зрелых биопленок. Чтобы удалить планктонные бактерии и бактерии, электростатически прикрепленные к гифам, промойте грибок, перенеся его на новую 6-луночную микропластину, заполненную крепким солевым раствором. Аккуратно встряхивайте тарелку в течение 1 минуты.

Перенесите грибок в новую 6-луночную микропланшет, содержащую 5 миллилитров стерильного 0,1 молярного калий-фосфатного буфера. Аккуратно встряхните тарелку в течение двух минут, а затем перенесите гриб в свежий буфер.

Сохраняя колонию грибка в буфере, используйте скальпель, чтобы разрезать колонию примерно пополам. Перенесите половину колонии, подлежащей окрашиванию, в чашку Петри, содержащую 1 миллилитр стерильной воды с добавлением соответствующего флуоресцентного красителя для визуализации грибковой сетки, такой как агглютинин зародышей пшеницы, конъюгированный с Alexa Fluor633. Затем инкубируйте образец в темноте.

После окрашивания промойте образец, переложив его на крышку чашки Петри, содержащую 10 миллилитров стерильного 0,1 молярного буфера калийфосфата, и осторожно встряхните в течение 1 минуты. Наполовину погрузите предметное стекло в крышку чашки Петри и аккуратно расположите срезанную часть, чтобы она плавала над предметным стеклом. Затем медленно поднимите сторону из буферного раствора, позволяя образцу аккуратно осесть на предметном стекле

Самым деликатным аспектом является позиционирование образца на предметном стекле. Во избежание разрушения биопленки образец и предметное стекло должны быть погружены во время позиционирования образца, и образец больше не должен перемещаться перед визуализацией.

Наконец, добавьте к образцу 10 микролитров антивыцветающей монтажной среды и накройте его стеклянной защитной крышкой.