Метод пробоподготовки для визуализации биопленкообразующих бактерий на гифах грибов

Введите связанную с целлофаном колонию грибов в флуоресцентно меченую бактериальную суспензию. Достаньте целлофан и инкубируйте.

Бактериальные клетки прикрепляются к поверхности гриба через поверхностные молекулы и рецепторы. Адгезивные бактерии выделяют внеклеточные полимерные вещества, состоящие из полисахаридов, белков и ДНК, захватывая бактериальные клетки и формируя структурную основу биопленки.

Промойте секцию в крепком солевом растворе, чтобы удалить слабо связанные бактерии

В фосфатном буфере разрежьте часть колонии.

Перенесите срез в стерильную воду, содержащую агглютинин зародышей пшеницы, или WGA, связанную с красным флуоресцентным красителем.

WGA, растительный белок, связывается с остатками N-ацетилглюкозамина и сиаловой кислоты, позволяя прикрепленному красителю флуоресцировать на клеточной стенке гриба.

Промойте срез в фосфатном буфере.

Частично погрузите предметное стекло в буфер. Пусть секция плавает на ней. Осторожно поднимите, чтобы секция осела без разрушения биопленки.

Установите монтажный материал, а затем покровное стекло для микроскопического анализа.

После выращивания бактерий в течение ночи центрифугируйте культуру при 5000 г в течение трех минут, а затем суспензируйте гранулу в 25 миллилитрах стерильного 0,1 молярного калий-фосфатного буфера. После повторения центрифугирования с помощью того же буфера отрегулируйте конечную концентрацию бактерий до 10 до девяти клеток на миллилитр.

Заполните микропланшет на 6 лунок 5 миллилитрами бактериальной суспензии. С помощью стерильного бритвенного лезвия разрежьте целлофановую мембрану грибковой культуры на квадраты, с одной колонией на каждой мембране. Затем с помощью щипцов осторожно удалите из твердой среды целлофановые квадраты, содержащие гифы, и перенесите их в отдельные лунки бактериальной суспензии.

Осторожно встряхивайте микропластину до тех пор, пока колонии грибков не оторвутся от целлофана. Затем удалите листы целлофана, оставив колонии грибов в тарелке. Инкубируйте микропланшет с легким перемешиванием при температуре 20 градусов Цельсия в течение некоторого времени в зависимости от используемых штаммов и анализируемой стадии.

Для P. fluorescens BBc6/L. bicolor инкубируйте культуры в течение 30 минут, чтобы получить биопленки на ранних стадиях, и до 16 часов для зрелых биопленок. Чтобы удалить планктонные бактерии и бактерии, электростатически прикрепленные к гифам, промойте грибок, перенеся его на новую 6-луночную микропластину, заполненную крепким солевым раствором. Аккуратно встряхивайте тарелку в течение 1 минуты.

Перенесите грибок в новую 6-луночную микропланшет, содержащую 5 миллилитров стерильного 0,1 молярного калий-фосфатного буфера. Аккуратно встряхните тарелку в течение двух минут, а затем перенесите гриб в свежий буфер.

Сохраняя колонию грибка в буфере, используйте скальпель, чтобы разрезать колонию примерно пополам. Перенесите половину колонии, подлежащей окрашиванию, в чашку Петри, содержащую 1 миллилитр стерильной воды с добавлением соответствующего флуоресцентного красителя для визуализации грибковой сетки, такой как агглютинин зародышей пшеницы, конъюгированный с Alexa Fluor633. Затем инкубируйте образец в темноте.

После окрашивания промойте образец, переложив его на крышку чашки Петри, содержащую 10 миллилитров стерильного 0,1 молярного буфера калийфосфата, и осторожно встряхните в течение 1 минуты. Наполовину погрузите предметное стекло в крышку чашки Петри и аккуратно расположите срезанную часть, чтобы она плавала над предметным стеклом. Затем медленно поднимите сторону из буферного раствора, позволяя образцу аккуратно осесть на предметном стекле

.

Самым деликатным аспектом является позиционирование образца на предметном стекле. Во избежание разрушения биопленки образец и предметное стекло должны быть погружены во время позиционирования образца, и образец больше не должен перемещаться перед визуализацией.

Наконец, добавьте к образцу 10 микролитров антивыцветающей монтажной среды и накройте его стеклянной защитной крышкой.