Анализ миграции резидентных Т-клеток в различных областях опухоли в режиме реального времени с помощью конфокальной микроскопии
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 4:23 мин • July 8th, 2025
Начните со среза опухоли легкого, содержащего резидентные Т-клетки.
Т-клетки мигрируют по опухолевому микроокружению и взаимодействуют с опухолевыми клетками и стромальными элементами, выполняя иммунные функции.
Состав опухолевого микроокружения сильно влияет на смещение и скорость вытеснения Т-клеток.
Добавляйте различные флуоресцентно связанные антитела для маркировки Т-клеток, опухолевых клеток и стромальных элементов в микроокружении.
Добавьте DAPI, который инфильтрирует клетки с поврежденной плазматической мембраной для окрашивания ядра, что позволяет визуализировать некротические участки внутри опухоли.
Рассмотрите окрашенный образец под конфокальным микроскопом.
Используя подходящий флуоресцентный свет, выберите интересующую область опухоли, содержащую резидентные Т-клетки. Оценивайте жизнеспособность клеток путем оценки DAPI-положительных клеток.
Для анализа в режиме реального времени определите временные интервалы и общее время записи.
Чтобы захватить изображения с z-стеком, начните с глубины ниже помеченных Т-клеток и захватывайте изображения через различные интервалы времени.
Используйте программное обеспечение для отслеживания для сравнения длины смещения Т-клеток и средней скорости в различных областях опухоли.
Разбавьте требуемые флуоресцентно меченые антитела и флуоресцентный ядерный краситель DAPI до требуемых конечных концентраций в среде RPMI, свободной от фенола докрасна. Далее извлеките планшет с культурой из инкубатора и с помощью тонкого наконечника отсосите жидкость из нержавеющей стали.
Теперь, не прикасаясь к срезу, добавьте 40 микролитров разведенных антител на каждый срез опухоли. Чтобы обеспечить окрашивание, инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. После того, как этап окрашивания будет завершен, с помощью тонких щипцов снимите шайбы. Затем аккуратно выньте ломтики и опустите их в фенол без красного RPMI1640 среднюю на 10 секунд. Поместите ломтики обратно на вкладыши для клеточных культур и добавьте каплю фенола, не содержащего красных RPMI1640 среды, на каждый ломтик. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем приступайте к визуализации.
За несколько часов до начала эксперимента установите температуру термокамеры микроскопа на 37 градусов Цельсия, затем подготовьте микроскоп так, чтобы он постоянно перфузировал срезы опухоли насыщенной кислородом феноловой средой RPMI и отасывал раствор в колбу для сбора отходов с помощью перистальтического насоса.
С помощью тонких щипцов извлеките окрашенный срез из шестилуночного планшета и перенесите его в 35-миллиметровую пластиковую чашку, наполненную средой RPMI, не содержащей фенола и красного, затем поместите на срез якорь для его поддержки. Затем поместите эту чашку Петри на визуализирующий столик микроскопа.
После подключения входного и выходного наконечников перфузионной системы включите перистальтический насос, чтобы насыщенная кислородом среда могла пройти через перфузионные трубки. Опустите объектив погружения в воду на срез и сфокусируйтесь на верхней части среза с помощью яркого поля света или с соответствующей длиной волны.
Затем, используя соответствующие фильтры, визуализируйте и выберите интересующую область, которая содержит все флуоресцентно помеченные клетки, представляющие интерес, а именно CD8 Т-клетки, опухолевые островки и CD90-положительные стромальные клетки. Настройте сеанс визуализации, используя соответствующую интенсивность лазера и время экспозиции в соответствии с яркостью наблюдаемых флуоресцентных сигналов. Затем установите толщину Z-стека для отображения внутри среза опухоли.
Затем выберите временной интервал изображения Z-стека и общее время записи для захвата изображений через определенные интервалы времени. После захвата и экспорта флуоресцентных изображений проанализируйте миграцию CD8 Т-клеток, как описано в текстовом протоколе.
Обзор
В данном исследовании изучается динамика миграции T-клеток в срезах опухоли легкого с акцентом на их взаимодействии с опухолевыми клетками и окружающим микроокружением. Методология включает флуоресцентное мечение и конфокальную микроскопию для визуализации поведения T-клеток в режиме реального времени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Онкология
- Клеточная биология
Теоретическое введение
- T-клетки играют решающую роль в иммунном ответе против опухолей.
- Микроокружение опухоли существенно влияет на поведение T-клеток.
- Понимание динамики T-клеток может помочь в разработке стратегий иммунотерапии рака.
- Флуоресцентное мечение позволяет детально наблюдать за клеточными взаимодействиями.
Цель исследования
- Проанализировать особенности миграции Т-клеток внутри опухолей легкого.
- Оценить влияние микроокружения опухоли на перемещение и скорость Т-клеток.
- Использовать передовые методы визуализации для наблюдения в режиме реального времени.
Используемые методы
- Подготовка срезов опухоли легкого с резидентными Т-клетками.
- Флуоресцентное мечение Т-клеток, опухолевых клеток и элементов стромы.
- Конфокальная микроскопия для визуализации и анализа клеточной динамики.
- Программное обеспечение для трекинга с целью оценки смещения и скорости Т-клеток.
Основные результаты
- Визуализация в режиме реального времени выявила отчетливые паттерны миграции T-клеток.
- Микроокружение опухоли влияло на скорость и смещение T-клеток.
- Флуоресцентное мечение позволило эффективно выделить некротические области и клеточные взаимодействия.
- Анализ данных позволил получить представление о поведении T-клеток в различных областях опухоли.
Выводы
- Исследование расширяет понимание динамики T-клеток в опухолях легких.
- Полученные результаты могут способствовать разработке таргетной иммунотерапии.
- Методы визуализации в режиме реального времени представляют ценность для изучения иммунного ответа в опухолях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Конфокальная визуализация в режиме реального времени миграции резидентных CD8 T-клеток в срезах опухоли легкого человека предоставляет ценные данные о динамике иммунных клеток в микроокружении опухоли. Эта возможность позволяет снизить механистические риски и провести валидацию мишеней для программ в области иммуноонкологии, повышая прогностическую достоверность на стыке фундаментальных исследований и трансляционной медицины. Количественные показатели миграции помогают принимать решения по портфелю препаратов, уточняя степень взаимодействия иммунных клеток и выявляя барьеры микроокружения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет проводить прямой анализ взаимодействий T-клеток с опухолью и T-клеток со стромой in situ.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественного определения перемещения и скорости иммунных клеток.
- Позволяет снизить механистические риски для иммуномодулирующих мишеней в контексте сложных тканей.
- Повышает прогностическую достоверность гипотез о взаимодействии иммунных клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создавать валидированные системы срезов опухоли ex vivo для последующего анализа миграции иммунных клеток.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели подвижности T-клеток в различных областях опухоли.
- Позволяет стандартизировать процессы визуализации и анализа при отслеживании иммунных клеток.
- Обеспечивает возможность скрининга соединений или биологических препаратов, модулирующих миграцию иммунных клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит показатели миграции иммунных клеток в соответствие с микроокружением опухолей человека, имеющим значение для конкретного заболевания.
- Связывает результаты поисковых исследований с доклинической валидацией за счет сохранения архитектуры и гетерогенности тканей.
- Обосновывает продвижение активов в области иммуноонкологии с учетом рисков на основе функциональных показателей иммунного ответа.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров инфильтрации и активности иммунных клеток.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс визуализации и анализа объединяет этапы от ранних открытий до трансляционных исследований, позволяя итеративно проверять гипотезы и снижать механистические риски в рамках разработки иммуноонкологических препаратов.
- Биология открытий: Количественная оценка миграции T-клеток и их взаимодействия с опухолевым и стромальным компонентами для выяснения путей передачи сигналов.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированных количественных анализов миграции для модуляторов иммунных клеток.
- Аналитика: Получение показателей смещения и скорости для надежного статистического сравнения различных областей опухоли.
- Трансляционные исследования: Сохранение контекста тканей человека для обеспечения преклинической преемственности и согласования биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление многократно используемой платформы ex vivo для изучения миграции иммунных клеток в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в прогнозах и снижает неопределенность механизмов при таргетировании иммунных клеток.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные и воспроизводимые рабочие процессы визуализации и анализа для исследований миграции иммунных клеток.
- Стратегическая ценность: помогает в принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределении капитала путем уточнения степени взаимодействия иммунной системы в тканях опухолей человека.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию активов в области иммуноонкологии с учетом рисков на основе функциональных показателей иммунитета.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией и манипуляций с живыми тканями.
- Необходим доступ к передовым платформам визуализации и программному обеспечению для трекинга.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов окрашивания, визуализации и анализа.
- Может потребоваться адаптация метода для различных типов опухолей или популяций иммунных клеток.
- Жизнеспособность и качество тканей могут ограничивать воспроизводимость и интерпретируемость анализа.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц
Похожие видео
0 Просмотры
Использование единой цепи MHC технологии расследовать Co агонизмом в человека CD8 + Т-клеток активации
Похожие видео
0 Просмотры
Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени
Похожие видео
0 Просмотры
Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии
Похожие видео
0 Просмотры
Live-ячейки изображения по переносу клеток, экспрессирующих флуоресцентно с метками Белки в трехмерной матрице
Похожие видео
0 Просмотры
Визуализация миграции опухолевых клеток в ткани глиобластомы с помощью покадровой сканирующей конфокальной микроскопии
Похожие видео
0 Просмотры
В режиме реального времени изображений миелоидных клеток Dynamics в Арс Мин / + Кишечная Опухоли на вращающемся диске конфокальной микроскопии
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице
Похожие видео
0 Просмотры
Модель культивирования органотипической кусочки глиобластомы человека для изучения миграции опухолевых клеток и специфических для пациента эффектов антиинвазивных препаратов
Похожие видео
0 Просмотры
Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026