Анализ миграции резидентных Т-клеток в различных областях опухоли в режиме реального времени с помощью конфокальной микроскопии

Начните со среза опухоли легкого, содержащего резидентные Т-клетки.

Т-клетки мигрируют по опухолевому микроокружению и взаимодействуют с опухолевыми клетками и стромальными элементами, выполняя иммунные функции.

Состав опухолевого микроокружения сильно влияет на смещение и скорость вытеснения Т-клеток.

Добавляйте различные флуоресцентно связанные антитела для маркировки Т-клеток, опухолевых клеток и стромальных элементов в микроокружении.

Добавьте DAPI, который инфильтрирует клетки с поврежденной плазматической мембраной для окрашивания ядра, что позволяет визуализировать некротические участки внутри опухоли.

Рассмотрите окрашенный образец под конфокальным микроскопом.

Используя подходящий флуоресцентный свет, выберите интересующую область опухоли, содержащую резидентные Т-клетки. Оценивайте жизнеспособность клеток путем оценки DAPI-положительных клеток.

Для анализа в режиме реального времени определите временные интервалы и общее время записи.

Чтобы захватить изображения с z-стеком, начните с глубины ниже помеченных Т-клеток и захватывайте изображения через различные интервалы времени.

Используйте программное обеспечение для отслеживания для сравнения длины смещения Т-клеток и средней скорости в различных областях опухоли.

Разбавьте требуемые флуоресцентно меченые антитела и флуоресцентный ядерный краситель DAPI до требуемых конечных концентраций в среде RPMI, свободной от фенола докрасна. Далее извлеките планшет с культурой из инкубатора и с помощью тонкого наконечника отсосите жидкость из нержавеющей стали.

Теперь, не прикасаясь к срезу, добавьте 40 микролитров разведенных антител на каждый срез опухоли. Чтобы обеспечить окрашивание, инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. После того, как этап окрашивания будет завершен, с помощью тонких щипцов снимите шайбы. Затем аккуратно выньте ломтики и опустите их в фенол без красного RPMI1640 среднюю на 10 секунд. Поместите ломтики обратно на вкладыши для клеточных культур и добавьте каплю фенола, не содержащего красных RPMI1640 среды, на каждый ломтик. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем приступайте к визуализации.

За несколько часов до начала эксперимента установите температуру термокамеры микроскопа на 37 градусов Цельсия, затем подготовьте микроскоп так, чтобы он постоянно перфузировал срезы опухоли насыщенной кислородом феноловой средой RPMI и отасывал раствор в колбу для сбора отходов с помощью перистальтического насоса.

С помощью тонких щипцов извлеките окрашенный срез из шестилуночного планшета и перенесите его в 35-миллиметровую пластиковую чашку, наполненную средой RPMI, не содержащей фенола и красного, затем поместите на срез якорь для его поддержки. Затем поместите эту чашку Петри на визуализирующий столик микроскопа.

После подключения входного и выходного наконечников перфузионной системы включите перистальтический насос, чтобы насыщенная кислородом среда могла пройти через перфузионные трубки. Опустите объектив погружения в воду на срез и сфокусируйтесь на верхней части среза с помощью яркого поля света или с соответствующей длиной волны.

Затем, используя соответствующие фильтры, визуализируйте и выберите интересующую область, которая содержит все флуоресцентно помеченные клетки, представляющие интерес, а именно CD8 Т-клетки, опухолевые островки и CD90-положительные стромальные клетки. Настройте сеанс визуализации, используя соответствующую интенсивность лазера и время экспозиции в соответствии с яркостью наблюдаемых флуоресцентных сигналов. Затем установите толщину Z-стека для отображения внутри среза опухоли.

Затем выберите временной интервал изображения Z-стека и общее время записи для захвата изображений через определенные интервалы времени. После захвата и экспорта флуоресцентных изображений проанализируйте миграцию CD8 Т-клеток, как описано в текстовом протоколе.