Метод проточной цитометрии FRET для обнаружения индуцированной тау-семенами агрегации репортерных белков

Возьмем культуру клеток млекопитающих, экспрессирующую повторный домен тау-связывающего белка микротрубочек.

Эти цитоплазматические тау-репортеры обладают склонной к агрегации мутацией и существуют в виде мономеров.

Репортеры сплавлены либо с флуорофором А, либо с В, при этом спектр излучения первого перекрывается со спектром поглощения последнего.

Добавьте липосому в комплексе с семенами тау или фибриллярными агрегатами тау-белка по всей длине.

При попадании в клетку липосома высвобождает семена в цитоплазме.

Высвобождающиеся семена опосредуют агрегацию тау-репортеров, приближая флуорофор А к флуорофору В.

Добавьте трипсин, чтобы отделить клетки, затем выполните фиксацию.

Проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра.

Из-за близости внутри агрегата при возбуждении передача энергии от флуорофора А к В через диполь-дипольное взаимодействие называется флуоресцентным резонансным переносом энергии или FRET.

Возбужденный флуорофор В излучает сигнал FRET, наличие которого указывает на агрегацию белков.

Чтобы переложить биосенсорные клетки в стерильных условиях, промойте каждую клеточную линию теплым PBS с последующей 3-минутной инкубацией с Trypsin-EDTA. Когда клетки отделятся, прекратите реакцию теплой питательной средой и немедленно перенесите клетки в коническую трубку.

Центрифугируйте ячейки, повторно суспендируя гранулу в свежей среде. Затем подсчитайте клетки и сделайте разведение клеток мастермиксом на 3 500 000 клеток на 13 миллилитров среды. С помощью многоканальной пипетки медленно перенесите 130 микролитров клеток в каждую лунку 96-луночного планшета, обработанного культурой тканей с плоским дном, стараясь разместить кончики пипеток в центре лунок, не касаясь дна пластины.

После того, как клетки будут покрыты, дайте им спокойно отстояться в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем инкубируйте пластину в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа и относительной влажности, превышающей или равной 80%. На следующий день, когда биосенсорные клетки сливаются на 60-65%, объедините восстановленную сывороточную среду, липосомный реагент и биологический источник семян для создания трансдукционных комплексов.

Затем аккуратно пипеткой нанесите 20 микролитров трансдукционного комплекса вниз по боковой стороне каждой отдельной лунки биосенсора и верните обработанные клетки в инкубатор еще на 24-48 часов. Перед сбором необработанные клетки будут проявлять только диффузионную флуоресценцию. Тем не менее, клетки, обработанные материалом семян тау, покажут яркие агрегаты через 1-2 дня.

Для забора клеток замените питательную среду 50 микролитрами Трипсина-ЭДТА, остановив реакцию через 5 минут 150 микролитрами охлажденной питательной среды. Немедленно переложите ячейки на 96-луночную пластину с круглым дном и гранулируйте ячейки. Отсадите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, а затем аккуратно, но тщательно ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах 2% параформальдегида на 10 минут. Затем снова раскрутите клетки и повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах охлажденного буфера для проточной цитометрии.