Метод проточной цитометрии FRET для обнаружения индуцированной тау-семенами агрегации репортерных белков

Возьмем культуру клеток млекопитающих, экспрессирующую повторный домен тау-связывающего белка микротрубочек.

Эти цитоплазматические тау-репортеры обладают склонной к агрегации мутацией и существуют в виде мономеров.

Репортеры сплавлены либо с флуорофором А, либо с В, при этом спектр излучения первого перекрывается со спектром поглощения последнего.

Добавьте липосому в комплексе с семенами тау или фибриллярными агрегатами тау-белка по всей длине.

При попадании в клетку липосома высвобождает семена в цитоплазме.

Высвобождающиеся семена опосредуют агрегацию тау-репортеров, приближая флуорофор А к флуорофору В.

Добавьте трипсин, чтобы отделить клетки, затем выполните фиксацию.

Проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра.

Из-за близости внутри агрегата при возбуждении передача энергии от флуорофора А к В через диполь-дипольное взаимодействие называется флуоресцентным резонансным переносом энергии или FRET.

Возбужденный флуорофор В излучает сигнал FRET, наличие которого указывает на агрегацию белков.

Чтобы переложить биосенсорные клетки в стерильных условиях, промойте каждую клеточную линию теплым PBS с последующей 3-минутной инкубацией с Trypsin-EDTA. Когда клетки отделятся, п