Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 4:37 мин. • July 8th, 2025
Обрабатывайте культуры нейронов с увеличением концентрации тестируемого токсина.
Токсин проникает в клетки и высвобождается в цитозоль.
В зависимости от своего потенциала, токсин может препятствовать слиянию везикуляров, подавляя высвобождение нейротрансмиттеров.
Замените среду буфером, содержащим определенные нейрофармакологические соединения, чтобы блокировать потенциалы нейронного действия.
Поместите чашку для культуры на электрофизиологический стол. Чтобы начать запись, соедините нейрон сома с пипеткой, содержащей записывающий электрод.
Применяйте постоянное отрицательное давление, чтобы аспирировать небольшую часть мембраны, образуя гигауплотнение, плотное уплотнение, обеспечивающее минимальные помехи во время записи.
Поддерживайте постоянное напряжение мембраны для измерения нейронных токов.
Подайте импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать мембрану, установив прямой контакт между нейроном и пипеткой.
Записывайте токи, производимые в нейроне из-за поглощения нейротрансмиттеров, называемых mEPSC.
Снижение частоты mEPSC при повышенном воздействии токсинов свидетельствует об ингибировании высвобождения нейромедиаторов.
Разведите ботулинический нейротоксин серотипа А до 100-кратной от желаемой конечной концентрации в культуральной среде ESN и подогрейте до 37 градусов Цельсия. Затем добавьте соответствующий объем токсина в культуры DIV 21+ ESN. Переверните чашку для культуры и верните в инкубатор.
В нужный момент времени аспирируйте питательную среду ESN и дважды промойте внеклеточным записывающим буфером или ERB. Затем добавьте 4 миллилитра ЭРБ с добавлением 5 микромолярного тетродотоксина для блокирования потенциалов действия и 10 микромолярного бикукуллина для антагонизма активности рецептора ГАМКА. Далее перенесите тарелку в электрофизиологическую установку. Ни перфузия, ни контроль температуры не требуются для измерения ингибирования синаптической передачи или анализа тумана.
После использования устройства для вытягивания боросиликатных пипеток с сопротивлением от 5 до 10 МОв заполните пипетку внутриклеточным записывающим буфером. Затем аккуратно окуните пипетку в силиконизирующий реагент. Закрепите записывающую пипетку на держателе электродов и прикрепите наполненный воздухом шприц к трубке, которая вставлена в держатель электрода. Обеспечьте постоянное положительное давление с помощью шприца, опуская записывающую пипетку в ERB.
После осторожного приземления записывающей пипетки на сому регистрируемого нейрона, захватите положительное давление, сломав пломбу на шприце. Подсоедините шприц и надавите на постоянное отрицательное давление с помощью мягкого вдоха, чтобы сформировать гигаомное уплотнение. Как только гигаомное уплотнение будет сформировано, уменьшите напряжение удержания до минус 70 милливольт, затем осторожно подайте короткие импульсы отрицательного давления с помощью шприца, чтобы взломать оптовую конфигурацию.
Отслеживайте скачки емкости в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что патч стабилен. Отмените скачки емкости в хакерском программном обеспечении и переключитесь в режим текущего зажима для мониторинга и записи потенциала мембраны в состоянии покоя. Без поправки на потенциалы перехода жидкости потенциал мембраны покоя должен быть в диапазоне от минус 67 до минус 82 милливольт.
Отрегулируйте коэффициент усиления на 2 милливольта на пикоампер. Переключитесь в режим напряжения-зажима и выполните непрерывный режим минус 70 милливольт, записывая от 3 до 5 минут для обнаружения миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов.
Анализируйте от 3 до 5 минут записанных данных для обнаружения MEPSC с использованием настроек по умолчанию для EPSC рецептора AMPA в мини-анализе. Собирайте и сохраняйте информацию об обнаруженных событиях. После сбора частот mEPSC для 8-12 контрольных образцов и от 8 до 12 образцов, обработанных ботулиническим нейротоксином, для каждого условия воздействия, проанализируйте частоту в зависимости от возраста и контрольной группы.