Получение и очистка рекомбинантных антител из клеток млекопитающих

Начните с пробирки, содержащей отдельные векторы для генов антител с тяжелой и легкой цепью.

Добавьте реагент для трансфекции для формирования комплексов с векторами.

Перенесите эту смесь в клетки-хозяева млекопитающих и инкубируйте для интернализации.

Добавьте агент против комков, чтобы способствовать равномерному распределению трансфицированных клеток, улучшая восстановление и рост клеток.

Добавьте антибактериально-антимикотический раствор для предотвращения загрязнения.

В клетке-хозяине векторы интегрируются в геном хозяина.

После транскрипции генов отдельные мРНК покидают ядро и подвергаются трансляции, образуя зарождающиеся цепочки антител.

Правильное складывание и модификация зарождающихся цепей дает тяжелые и легкие цепи.

Эти цепи объединяются, образуя полностью функциональные антитела, которые затем высвобождаются во внеклеточную среду.

Соберите среду и центрифугируйте. Отфильтруйте надосадочную жидкость.

Пропустите фильтрат через очистительную колонку, которая позволяет избирательно связывать антитела.

Используя элюирующий буфер, вымывайте очищенные антитела.

Выращивайте клетки CHO в 200 миллилитрах среды в длинные колбы Эрленмейера. Соедините 5 миллилитров среды CHO freestyle с 50 микрограммами вариабельной тяжелой клонированной ДНК и 75 микрограммами вариабельной легкой клонированной ДНК в 15-миллилитровой пробирке. Затем сделайте трубку вихревой. Оставьте смесь при комнатной температуре на 5 минут. Добавьте в раствор ДНК 750 микролитров 1 миллиграмм на миллилитр полиэтиленаминового сырья и агрессивно перегоняйте его в течение 30 секунд.

Оставьте смесь при комнатной температуре еще на 5 минут. Добавьте всю смесь в ячейки СНО, вручную встряхивая колбу. Немедленно инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая при 130 оборотах в минуту.

На следующий день добавьте в клетки 2 миллилитра 100-кратного антикомковатого агента и 2 миллилитра 100-кратного антибактериального антимикотического раствора. Инкубируйте колбы при температуре от 32 до 34 градусов Цельсия с встряхиванием при 130 об/мин. Продолжайте культивировать клетки в течение 10-11 дней, добавляя 10 миллилитров триптона N1 и 2 миллилитра 100-кратной добавки глутамина каждый пятый день. Подсчитывайте клетки каждые три дня, чтобы убедиться, что жизнеспособность клеток остается выше 80%. На 10 или 11-й день соберите среду для очистки антител путем центрифугирования культуры при 3000 g и 4 градусах Цельсия в течение 40-60 минут. Затем отфильтруйте прозрачный фильтр с помощью фильтра для бутылок 0,22 микрометра.

Чтобы очистить антитела, уравновесьте колонку белка А двумя объемами связывающего буфера. Пропустите отфильтрованную среду через колонку со скоростью расход 1 миллилитр в минуту. Затем промойте колонку двумя объемами связующего буфера. Используйте 5 миллилитров элюирующего буфера, чтобы разбавить антитело на фракции по 500 микролитров.