Измерение активации fc-опосредованных эффекторных функций антителами к ГК

Возьмем, к примеру, последовательные разведения антитела, нацеленного на вирус гриппа гемагглютинин, или ГК, гликопротеин, состоящий из шаровидной головки и стебля.

Добавляйте разведения к трансфицированным клеткам млекопитающих, экспрессирующим поверхностно-связанную ГК. Антитела связываются с областями стебля ГК, образуя иммунные комплексы.

Введение сконструированных Т-клеток, экспрессирующих Fc-рецепторы и кодирующих люциферазный репортер под контролем транскрипционного фактора NFAT.

Во время инкубации антитело, связанное с ГК, связывается с Fc-рецептором, в то время как головка ГК связывается с сиаловой кислотой, вызывая активацию Т-клеток и увеличивая концентрацию цитозольного кальция.

Эта активация инициирует сигнальный каскад, который приводит к дефосфорилированию NFAT, запуская его ядерную транслокацию.

NFAT связывается со своими ответными элементами в геноме, управляя экспрессией люциферазы.

Добавьте проникающий в клетки биолюминесцентный субстрат. Люцифераза окисляет подложку, вырабатывая сигнал.

Снижение люминесценции при снижении концентрации антител подтверждает активацию Т-клеток, опосредованную специфическими антителами к стеблю HA.

Чтобы оценить способность специфических антител, представляющих интерес, нацеливаться на клетки, экспрессирующие гемагглютинин, замените надосадочную жидкость вирусно инфицированных клеточных культур 25 микролитрами антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).

Затем в отдельном 96-луночном планшете проводят 4-кратное разведение интересующих антител в тройной и свежей среде ADCC, начиная с 10 мкг на миллилитр в соответствии со схемой, и заботясь о том, чтобы включить фон и контроль без антител.

Когда все антитела будут разбавлены, переведите 25 микролитров разведенного антитела в соответствующие лунки в экспериментальной клеточной пластине и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. Через 15 минут добавьте в 7,5 раз по 10 к 4-й модифицированной эффекторной клетке Jurkat, экспрессируя соответствующий Fc-рецептор на лунку в 25 микролитрах среды ADCC для получения конечного объема 75 микролитров среды ADCC на лунку.

Верните планшет в инкубатор для клеточных культур на 6 часов, разморозив буфер субстрата люциферазы на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение последнего часа инкубации. Когда буфер будет готов, добавьте 75 микролитров буфера для субстрата люциферазы во все лунки, кроме контрольной лунки фона, и считайте показания пластины на люминометре. Затем можно рассчитать кратную индукцию антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности в трансфицированных или инфицированных клеточных культурах.