Генерация вариантов вируса гриппа против нейтрализующих антител

Возьмем суспензию вируса гриппа, содержащую как дикий тип, так и мутантные штаммы.

Гликопротеин вирусной оболочки, называемый гемагглютинином, или ГК, связывается с сиаловой кислотой на поверхности клетки-хозяина, опосредуя проникновение вируса.

Добавьте нейтрализующее антитело в уменьшающихся концентрациях, которое связывается с ГК, блокируя сайт связывания сиаловой кислоты.

Мутантные штаммы, несущие мутации в HA, которые помогают избежать нейтрализации антител, называются escape-вариантами.

Введите смесь в очищенные от патогенов куриные яйца, доставляющие вирусы в аллантоисную жидкость, и инкубируйте.

Нейтрализованные антителами вирусы не могут проникать в клетки хориоаллантоисной мембраны. Ненейтрализованные мутантные вирусы проникают в клетки, реплицируются и высвобождаются в аллантоисную жидкость.

Соберите популяционную аллантоисную жидкость, содержащую вирус.

Введите специфическое антитело к ГК в уменьшающихся концентрациях, которое нейтрализует другие штаммы, за исключением эскейп-вариантов.

Введите куриные эритроциты или эритроциты. Ненейтрализованные варианты побега связываются с клетками, вызывая слипание эритроцитов — так называемое гемагглютинирование, подтверждая генерацию вариантов побега.

Нейтрализующие антитела, обладающие активностью HI, дополнительно анализируют путем получения сначала 4 разведений представляющего интерес антитела в возрастающих концентрациях в 1 раз PBS в объеме 100 мкл на разведение. Далее подготовьте вирусный запас из 1 миллиона бляшечных единиц на миллилитр в 1 раз PBS в объеме 400 микролитров.

Затем смешайте 100 микролитров 1 миллиона бляшечных единиц на миллилитр вируса со 100 микролитрами каждого разведения антител или 100 микролитров 1 PBS. Инкубируйте образцы в течение одного часа в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.

После короткого вортекса введите по 200 микролитров каждой смеси в определенные эмбриональные куриные яйца, не содержащие патогенов. Затем инкубируйте яйца при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа в течение 40-44 часов. После инкубации пожертвуйте инфицированными вирусом эмбриональными яйцами, поместив их при температуре 4 градуса Цельсия минимум на 6 часов. Затем соберите аллантоисную жидкость из яиц, как описано ранее.

Наконец, подтвердите варианты побега, выполнив анализ HI, как описано в текстовом протоколе.