Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 3:32 мин. • July 8th, 2025
Примите суспензию естественных киллеров, или NK-клеток.
Добавьте моноклональные антитела к CD20 и инкубируйте.
В отсутствие раковых клеток-мишеней, экспрессирующих антиген CD20, Fc-область антител связывается с рецепторами FcγRIIIa на поверхности NK-клеток.
После инкубации добавьте охлажденную среду. Центрифугируйте и удалите несвязанные антитела.
Далее добавьте антитела к легкой цепи κ человека. Инкубировать.
Эти вторичные антитела связываются с κ легкой цепью моноклональных антител.
Сшивание антител имитирует связывание с антигеном-мишенью, запуская внутриклеточный сигнальный каскад.
Это вызывает искусственную стимуляцию NK-клеток в отсутствие раковых клеток.
Активированные NK-клетки подвергаются цитоскелетной перестройке и высвобождают цитотоксические гранулы.
Далее клетки вырабатывают хемокины и цитокины.
По истечении желаемой продолжительности добавьте охлажденную среду, чтобы остановить стимуляцию клеток.
Центрифугируйте пробирку. Соберите надосадочную жидкость и клеточную гранулу для последующего анализа функций эффекторных NK-клеток, опосредованных антителами.
Диспонируйте 100 микролитров ресуспендированных естественных клеток-киллеров в 1,5-миллилитровые пробирки или 96-луночную U-образную пластину и поместите клетки на лед. Приготовьте ритуксимаб или другое интересующее антитело в концентрации 100 мкг на миллилитр.
Добавьте по 1 микролитру в каждую пробирку с клетками для окончательной концентрации 1 микрограмм на миллилитр и инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут. Во время инкубации приготовьте раствор антитела к легкой цепи каппы против человека в средах в концентрации 50 мкг на миллилитр. Количество необходимого раствора антитела составит 50 микролитров на образец клетки.
Подогрейте раствор антитела до 37 градусов Цельсия на теплоблоке или на водяной бане. Когда инкубация клеток будет завершена, добавьте 1 миллилитр ледяной среды в каждую пробирку и центрифугируйте клетки при 135-кратном g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Еще раз промойте клетки 1 миллилитром ледяной среды. Аспирируйте надосадочную жидкость после последнего мытья и добавьте 50 микролитров раствора антител к легкой цепи каппы против человека для активации клеток. Немедленно поместите образцы клеток при температуре 37 градусов Цельсия на тепловой блок или на водяную баню и инкубируйте их до нужных временных точек для анализа или других процедур.
Лучший способ работы с несколькими образцами — использовать плавающий штатив в водяной бане с температурой 37 градусов, который можно снять и положить на лед, чтобы немедленно остановить все реакции.