Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 2:53 мин. • July 8th, 2025
Возьмем, к примеру, эукариотические векторы экспрессии, кодирующие либо тяжелую цепь антител, либо легкую цепь антител, клонированную из антиген-специфических В-клеток.
Ввести полиэтиленимин, катионный полимер, который электростатически взаимодействует с отрицательно заряженными векторами, образуя полиплексы.
Инкубируйте клетки млекопитающих с полиплексами, которые прикрепляются к клеткам и интернализуются посредством эндоцитоза. Образующиеся эндосомы сливаются с лизосомами.
Полимеры в полиплексах вызывают осмотическое набухание везикулы, приводящее к ее разрыву и высвобождению векторов.
Высвобожденные векторы попадают в ядро и транскрибируются в мРНК с тяжелой и легкой цепью, которые транслируются через рибосомы эндоплазматического ретикулума.
Полученные пептидные цепи собираются в антитела, которые транспортируются к Гольджи и упаковываются в секреторные везикулы.
При слиянии секреторных везикул и клеточной мембраны антитела высвобождаются внеклеточно
.Соберите содержащую антитела надосадочную жидкость для последующих анализов.
За день до трансфекции засейте 15 000 эмбриональных клеток почек человека в 200 микролитрах модифицированной орлиной среды Dulbecco с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки в каждой лунке 96-луночного планшета с плоским дном. Затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи при 5% углекислом газе. Котрансфектируют клетки с помощью линейного реагента для трансфекции на основе производного полиэтиленимина. Разведите 0,5 микролитра реагента для трансфекции ДНК с 10 микролитрами 150 миллимоляров хлорида натрия.
Затем разведите 0,125 мкг каждого вариабельного вектора с тяжелой и легкой экспрессией цепей в 10 микролитрах 150 миллимолярного хлорида натрия. Перебейте все разведения на 10 секунд каждому. Затем смешайте ранее разведенный реагент для трансфекции ДНК с 10 микролитрами раствора ДНК. Быстро переведите смесь для трансфекции ДНК в течение 15 секунд, и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
Добавьте смесь для трансфекции ДНК по каплям на клетки, а затем аккуратно взболтайте пластину. Замените среду через 16 часов после трансфекции и культивируйте клетки в течение пяти дней в среде, не содержащей сыворотки, при температуре 37 градусов Цельсия.