Анализ для выявления аутоантител в сыворотке крови человека с использованием культуры нейронов гиппокампа

Возьмем эмбрион крысы гиппокампа.

Добавьте трипсин. Инкубация для опосредования разрушения тканевого матрикса, ослабления клеток гиппокампа.

Разбавляем буфером. Инкубируйте для продолжения ферментативного пищеварения с трипсином.

Далее переложите тканевую массу в пробирку, содержащую среду. Повторяйте пипетку для механической диссоциации на отдельные клетки.

Затравочные клетки на покровных стеклах, покрытых поли-L-лизином, внутри культуральных планшетов.

инкубировать. Клетки гиппокампа прилипают к покрытым поверхностям. Нейроны развивают пластинку и удлиняют малые нейриты.

Далее нейриты разрастаются аксональными и дендритными отростками, образуя нейронную сеть.

Зрелые нейроны экспрессируют синаптические возбуждающие рецепторы, N-метил-D-аспартатные рецепторы или NMDAR.

После инкубации промойте покровные листы с помощью фильтрующего материала.

Добавьте разведенную сыворотку пациента с аутоиммунным энцефалитом. Аутоантитела связываются с нейрональными NMDAR.

Промойте буфером, а затем закрепите ячейки.

Добавьте меченные флуорофорами вторичные антитела, которые связываются с NMDAR-связанными аутоантителами.

Постирайте с буфером. Наденьте защитное стекло на монтажный носитель, содержащий DAPI, чтобы окрашивать ядра.

Микроскопически наблюдают за сигналами флуоресценции на нейронах, свидетельствующими о наличии аутоантител в сыворотке крови.

Для ферментативной диссоциации гиппокампа в 1 миллилитр 2,5% трипсина в 50-миллилитровой пробирке, содержащей гиппокамп, после доведения объема в пробирке до 5 миллилитров с ГБСС, инкубировать пробирку в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы еще больше развести трипсин, добавьте 10 миллилитров предварительно подогретого HBSS, и поместите трубку обратно на водяную баню, установленную при температуре 37 градусов Цельсия, на 5 минут.

Затем с помощью микропипетки объемом 1000 микролитров перенесите гиппокамп, проявляющийся в виде слизистой массы, в 50-миллилитровую трубку, и инкубируйте ткань с 6 миллилитрами предварительно нагретого HBSS в течение 5 минут, как показано на рисунке. Чтобы диссоциировать ткань механическим способом, переложите массу гиппокампа в 2-миллилитровую трубку с коническим дном. После добавления 1 миллилитра предварительно нагретого фильтрующего материала DMEM гомогенизируйте гранулу с помощью микропипетки объемом 1000 микролитров, осторожно отсасывая вверх и вниз.

Следя за тем, чтобы не образовались пузырьки, повторите аспирацию вверх-вниз от 10 до 20 раз с помощью предварительно вытянутой стеклянной пипетки, кончик которой должен соприкасаться с коническим дном трубки, пока смесь не станет полупрозрачной. Пересчитайте ячейки, прежде чем равномерно распределить их на 3,5-сантиметровой тарелке перекрестно-встряхивающими движениями. Как только это будет сделано, поместите чашку в инкубатор с 5% углекислым газом.

Для флуоресцентного иммуноокрашивания 14-дневных клеток in vitro добавьте образец, содержащий антитела против NMDAR, в покровные стекла и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через час обработайте образец 4% формальдегидом в PBS, в качестве фиксирующего раствора, при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем образец трижды промывают PBS в течение 5 минут каждый, после чего добавляют вторичное антитело козье античеловеческое Alexa Fluor 488 в разведении от 1 до 1000 в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем закрепите покровные стекла, содержащие образец, с жидкостной средой для монтажа и отсасывайте оставшуюся жидкость.