Анализ для измерения титра нейтрализующих антител, специфичного к респираторно-синцитиальному вирусу

Принимайте серийно разбавленную, инактивированную теплом сыворотку крови человека, содержащую респираторно-синцитиальный вирус или РСВ-специфические нейтрализующие антитела.

Добавьте вирусную суспензию. Антитела нейтрализуют вирусы в зависимости от разведения.

Введите смесь в монослои эпителиальных клеток человека и инкубируйте для адсорбции вирусов.

Выбросьте смесь. Добавьте карбоксиметилцеллюлозосодержащие среды, формируя полутвердое покрытие. Инкубировать.

РСВ использует механизмы клетки-хозяина для синтеза вирусной РНК и белков, которые впоследствии собираются и отпочковываются в виде отдельных вирионов.

Инфицированные клетки в конечном итоге погибают. Карбоксиметилцеллюлоза ограничивает движение вируса, вызывая локализованную инфекцию и гибель клеток, образуя бляшки.

Снимите накладку.

Зафиксируйте ячейки ацетонсодержащим буфером. Введите блокирующий буфер, содержащий детергент, для проникновения в клетки и предотвращения неспецифических взаимодействий антител.

Добавьте первичные антитела, нацеленные на вирусные белки.

Наложение флуорконъюгированных вторичных антител, нацеленных на первичные антитела.

Сделайте снимки лунок для количественного определения флуоресцентных бляшек.

Самый высокий уровень разведения сыворотки, нейтрализующий пятьдесят процентов РСВ, представляет собой титр нейтрализации.

Перед инокуляцией клеток A549 с помощью РСВ исследуйте клеточную пластину под световым микроскопом, чтобы подтвердить, что монослои клеток A549 на 80% сливаются. Затем аккуратно переверните пластину, чтобы выбросить носитель, и слегка промокните пластину на стерильном впитывающем бумажном полотенце. После каждого умывания фильтруемым, стерильным ПБС.

Затем добавьте 100 микролитров на лунку вирусно-сывороточной смеси в соответствующие лунки на клеточной пластине А549 в соответствии с шаблоном пластины, представленным в рукописи, и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение одного часа. В конце инкубации с помощью пипетки удалите 90 микролитров на лунку и добавьте 100 микролитров среды, содержащей 1X M 199, 1,5% CMC и 2% FCS и пенициллин-стрептомициновую смесь. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение трех дней.

Чтобы зафиксировать и разработать пластину для анализа, сначала осторожно переверните инфицированную РСВ клеточную пластину A549, чтобы удалить среду, содержащую M 199, CMC, 2% FCS и смесь пенициллина и стрептомицина. Затем медленно добавьте по 200 микролитров фиксирующего буфера в каждую лунку. Выдерживайте тарелку при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем выбросьте фиксирующий буфер и аккуратно промокните на впитывающем бумажном полотенце.

Оставьте тарелку лицевой стороной вниз для высыхания на 10 минут. Затем с помощью фильтрованного PBS-буфера, содержащего 0,05 полисорбата-20, делают 5% раствор для блокирования молока. Добавьте в каждую лунку по 200 микролитров блокирующего раствора, и выдержите тарелку при комнатной температуре в течение 30 минут. В конце инкубации аккуратно переверните пластину, чтобы сбросить раствор, и промокните на впитывающем бумажном полотенце.

Чтобы получить первичное антитело, разведите в блокирующем растворе от 1 до 500 антител к РСВ Goat X RSV. Добавьте по 50 микролитров в каждую лунку, и выдержите тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Трижды вымойте пластину отфильтрованным полисорбатом PBS.

Затем создайте вторичное антитело, разбавив от 1 до 5000 антикозьего иммуноглобулина G AlexaFluor Donkey в блокирующем растворе. Добавьте в каждую лунку по 50 микролитров и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Пять раз вымойте тарелку отфильтрованным полисорбатом PBS.

Чтобы подсчитать бляшки с помощью автоматического считывателя пятен, сначала используйте неиспользуемый 96-луночный планшет для калибровки прибора, введя настройки подсчета в канал FITC. Затем прочитайте клеточную пластину, заверните ее в фольгу и храните при температуре 4 градуса Цельсия. Затем проверьте изображения лунок на наличие артефактных бляшек или разрушенных монослоев клеток и исключите лунки с разрушенными монослоями клеток.