Обнаружение островковых аутоантител человека с помощью электрохемилюминесцентного анализа

Чтобы обнаружить островковые аутоантитела — биомаркер диабета 1 типа — берут образцы сыворотки крови человека и добавляют уксусную кислоту для ингибирования интерферирующих компонентов.

Инкубируйте, а затем добавьте щелочной буфер для нейтрализации кислоты.

Перенесите обработанную сыворотку в многолуночный планшет, содержащий смесь аутоантигенов островков человека, включая биотинилированный захват и конъюгированные с рутением антигены, каждый в оптимальной концентрации для анализа.

Островковое аутоантитело в положительном образце соединяет рутений-конъюгированный антиген с биотинилированным антигеном захвата, образуя комплекс антиген-антитело.

Переложите смесь в покрытую стрептавидином электрохемилюминесцентную пластину, предварительно обработанную блокирующим агентом и снабженную рабочим и противоэлектродами.

Инкубируйте, чтобы обеспечить взаимодействие биотинилированного комплекса со связанным стрептавидином, а затем промойте.

Добавьте буфер, содержащий трипропиламин или ТФК.

В электрохемилюминесцентном приборе подача напряжения между электродами инициирует окисление рутения и ТФК, образуя радикалы ТФК.

Радикалы TPA возбуждают комплексы рутения, которые испускают фотоны, возвращаясь в основное состояние.

Высокая хемилюминесценция в положительном образце свидетельствует о наличии островковых аутоантител.

Смешайте в пробирке островковый аутоантиген человека с биотином или сульфо-меткой в молярном соотношении 1:5 и накройте пробирку алюминиевой фольгой, так как обе метки светочувствительны. Затем выдержите трубку в течение часа при комнатной температуре. Тем временем, когда идет инкубация, загрунтуйте спиновую колонну двукратным фосфатно-солевым буфером.

Затем центрифугируйте колонку при 1000 умноженных на g в течение двух минут каждый раз. Затем центрифугируйте смесь аутоантигенных меток в спиновой колонке при 1000 умноженных на g в течение 2 минут. Затем аликвотируйте и храните помеченный антиген при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Затем используйте рациональную концентрацию меченного биотином антигена, меченного сульфо-меткой, на основе шахматного анализа для антигенного буфера для приготовления 3 миллилитров раствора антигена на 96-луночный планшет.

Затем в каждую лунку добавьте по 4 микролитра сыворотки и доведите итоговый объем до 20 микролитров с 1-кратным фосфатно-солевым буфером. Затем добавьте по 20 микролитров меченого раствора антигена в каждую лунку, и накройте пластину герметизирующей пленкой для предотвращения попадания света. Затем переложите тарелку на шейкер при комнатной температуре на 2 часа.

Как только шейкер остановится, оставьте тарелку при температуре 4 градуса Цельсия в холодильнике на 18-24 часа. Теперь смешайте 15 микролитров сыворотки с 18 микролитрами 0,5 молярной уксусной кислоты для каждого образца и инкубируйте то же самое при комнатной температуре в течение 45 минут.

На основании шахматного анализа для приготовления раствора антигена используют рациональную концентрацию биотина, меченного сульфо-меткой.

Затем внесите 35 микролитров антигенного буфера в каждую лунку нового ПЦР-планшета. Непосредственно перед тем, как хор инкубации сывороточной смеси будет завершен, добавьте 3,8 микролитра 1 молярного трис-буфера при pH девять вдоль боковой части каждой лунки на антигенной пластине.

Как только инкубация закончится, быстро перенесите 25 микролитров сыворотки, обработанной уксусной кислотой, в каждую лунку антигенной пластины и перемешайте раствор. Затем накройте ПЦР-планшет герметизирующей фольгой, чтобы избежать попадания света, и поместите на шейкер при комнатной температуре на 2 часа. Как только это будет сделано, перенесите тарелку при температуре 4 градуса Цельсия в холодильник и выдерживайте от 18 до 24 часов.

Достаньте пластину со стрептавидином из холодильника при температуре 4 градуса Цельсия и дайте пластине нагреться до комнатной температуры. После того, как стрептавидиновая пластина достигнет комнатной температуры, добавьте в каждую лунку по 150 микролитров 3% блокатора А, накройте ПЦР-планшет герметизирующей пленкой и выдержите в холодильнике на ночь.

На следующий день достаньте пластину со стрептавидином из холодильника и изгоните буфер из лунок. Затем высушите тарелку, поставив ее вверх дном на сухие бумажные полотенца, чтобы оставшийся буфер пропитался. Затем добавьте 150 микролитров 1-кратного буфера PBST, чтобы промыть колодец в течение трех последовательных промывок.

Далее перелейте по 30 микролитров сывороточного антигена инкубируйте в каждую лунку стрептавидиновой пластины, и накройте пластину фольгой, чтобы избежать попадания света. Затем переложите тарелку на шейкер при комнатной температуре на час. Через час выбросьте сывороточный антиген инкубируйте с тарелки и добавьте 150 микролитров 1-кратного буфера PBST, чтобы промыть лунку три раза. Как только промывка закончится, добавьте 150 микролитров буфера для чтения в каждую лунку для чтения на планшетном ридтере.