$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Начните с чашки для культивирования, содержащей фиксированные формалином, наполненные желатином криосекции тощей кишки мышей с пучковыми клетками с апикальными микроворсинками и катушкообразной сомой.
Умойте с буфером, содержащим моющее средство, чтобы проникнуть в клеточные мембраны.
Добавьте раствор для восстановления щелочного антигена. Инкубируйте для разрыва индуцированных фиксацией белковых сшивок, обнажая белки для окрашивания.
Нанесите блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.
Наложение первичных антител, нацеленных на актин-связывающий белок, специфически фосфорилированный в клетках пучка.
Удалите несвязанные антитела. Введите смесь флуорофор-конъюгированных вторичных антител, ДНК-связывающего красителя и фаллоидин-флуоресцентного конъюгата красителя.
Вторичные антитела связываются с первичными антителами, фаллоидин-флуоресцентный краситель конъюгирует актин, а ДНК-связывающий краситель помечает ядра клеток.
Удалите несвязанные компоненты и добавьте буфер без моющих средств.
Перенесите секцию на предметное стекло с клеевым покрытием, закрепив его с помощью носителя.
Под конфокальным микроскопом зеленые золотниковидные клетки с усиленной флуоресценцией на верхушке просвета и расширенной массой красного корешка указывают на наличие пучковых клеток.
Чтобы подготовить срезы тощей кишки, начните с установки температуры криостатной камеры и температуры объекта на отметку минус 22 градуса Цельсия. Поместите замороженный тканевый блок в криоформу в криокамеру не менее чем на 15 минут. Через 15 минут разрежьте блок пополам лезвием бритвы, чтобы обнажить поперечный срез тощей кишки. Установите одну половину блока на адаптер для криостата. Разделите наполненную желатином тощую кишку на участки толщиной 30 микрон. С помощью замороженных щипцов аккуратно перенесите срезы в 35-миллиметровую чашку для культур, содержащую 3 миллилитра PBS.
Промыв секции три раза в течение 5 минут каждая 3 миллилитрами PBS-T, добавьте 3 миллилитра свежеприготовленного раствора для извлечения антигена в посуду, содержащую свободно плавающие секции. Затем закройте крышку, заклейте зазор между чашкой и крышкой полоской виниловой ленты и выдерживайте при температуре 50 градусов Цельсия в гибридизационном инкубаторе в течение трех часов без встряхивания.
После иммуноокрашивания перенесите чашку окрашенных срезов в PBS в стереоскопический микроскоп. Поместите 200 микролитров PBS в каплю в центр предметного стекла с покрытием AMS. Затем с помощью наконечника для дозатора P200 перенесите одну секцию тощей кишки из чашки в каплю.
Отрегулировав выравнивание секции, аспирируйте все оставшиеся PBS вокруг секции. Добавьте 20 микролитров водного монтажного материала и поместите покровное стекло поверх носителя. Немедленно загерметизируйте края покровного стекла монтажным материалом на основе ксилола и дайте высохнуть в течение двух-трех часов перед началом конфокальной микроскопии.