Метод иммунофлуоресценции с двойным мечением для визуализации белков хозяина и патогена в инфицированной клетке

Начинают с фиксированных и проникающих эпителиальных клеток, инфицированных патогенным паразитом.

Добавьте блокирующий буфер для предотвращения связывания неспецифических антител.

Накладывают на мышь поликлональные первичные антитела, специфически взаимодействующие с белками паразита.

Добавьте дальний красный флуорофор меченный вторичные антитела, которые взаимодействуют с паразитическими первичными антителами, связанными с белками.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела. Блокируйте антителами против мыши, которые связываются с первичными антителами, сводя к минимуму перекрестную реактивность во время мечения белка хозяина.

Добавьте мышиные моноклональные первичные антитела, нацеленные на рибонуклеопротеины хозяина в эпителиальных клетках.

Наложите смесь зеленых меченых флуорофором вторичных антител и красного фторконъюгированного фаллоидина, облегчая мечение первичных антител, связанных с белками хозяина, и актина соответственно.

Постирайте с помощью буфера. Монтируйте с использованием среды, содержащей краситель ДНК, придавая синюю окраску ядру хозяина, ядру паразита и кинетопласту.

Проанализируйте образцы с помощью конфокального микроскопа. Метод иммунофлуоресценции с двойным мечением показывает зеленые белки хозяина и красные паразитические белки, что позволяет точно локализовать их.

Добавьте ячейки LLC-MK2 в 24-луночные планшеты, содержащие стерилизованные УФ-стерилизованными закругленными покровными стеклами, и дайте им отстояться в течение 16 часов. Затем, чтобы заразить клетки, добавьте в каждую лунку надосадочную жидкость, содержащую T. cruzi, и инкубируйте в течение шести часов. Далее 5 раз промойте покровные листы, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, PBS.

Затем зафиксируйте клетки с помощью 2% параформальдегида и PBS. Через 10 минут промойте покровные стекла три раза по 5 минут каждый PBS, а затем промойте покровные стекла неионогенным моющим средством в течение 10 минут.

После трех 5-минутных промываний PBS инкубируйте покровные стекла в блокирующем растворе в течение 30 минут, после чего следует еще одна 30-минутная инкубация либо с моноклональным мышиным, либо с поликлональным антителом. После промываний инкубировать покровные стекла в течение 30 минут с вторичным антителом в блокирующем растворе и фаллоидином для окрашивания актиновых филаментов в клетке-хозяине.

Затем еще раз трижды промойте покровные стекла PBS, прежде чем нанести небольшое количество реагента для защиты от выцветания со средой DAPI на поверхность предметного стекла. С помощью щипцов аккуратно наклоните покровный лист в среде, чтобы предотвратить образование пузырьков.

Для двойного мечения, после инкубации покровных стекол и блокирующего раствора, как было показано ранее, инкубируйте их в мышином поликлональном антителе в течение 30 минут. Затем промойте покровные листы три раза в течение 5 минут каждый с PBS, прежде чем инкубировать их со вторичным антителом в течение 30 минут.

Затем, после трех промываний PBS, выполните второй этап блокировки с помощью AffiniPure rabbit anti-mouse IgG, разведенного в блокирующем растворе. Через 30 минут снова промойте покровные листы PBS, прежде чем инкубировать их с мышиным моноклональным антителом в течение еще 30 минут.

Затем, после трех промываний PBS, инкубируйте покровные стекла с антителом IgG2b к мышам козы и фаллоидином. Затем, после трех промывок PBS, нанесите монтажный реагент против выцветания, как было показано ранее.