Метод аффинной хроматографии для очистки моноклональных антител

Возьмем колонку аффинной хроматографии, содержащую шарики агарозы, конъюгированные с белком А, белком, связывающим антитела.

Добавьте связующий буфер с нейтральным pH для балансировки колонки.

Загрузите супернатант культуры из клеточной культуры, продуцирующей антитела, содержащей моноклональные антитела и загрязняющие клеточные белки.

Нейтральный pH способствует связыванию белка А с Fc-областью антител, в то время как загрязняющие вещества проходят через него.

Измерьте поглощение ультрафиолета проходящим потоком, чтобы создать хроматограмму. Высокая абсорбционная способность при загрузке образца указывает на наличие несвязанных белков в протоке.

Промойте колонку связующим буфером, чтобы удалить неспецифически связанные загрязнения.

Добавьте элюирующий буфер с низким pH, чтобы нарушить взаимодействие антител к белку А. Соберите элюированные антитела, контролируя пик абсорбции.

Нейтрализуйте pH для предотвращения деградации антител и перенесите их в центробежный фильтр.

Центрифуга для концентрации антител и ресуспендирования в буфере для последующих анализов.

После подготовки буферов и инициализации системы FPLC в соответствии с текстовым протоколом с помощью редактора методов настройте следующие шаги запуска. Уравновесьте систему с помощью пяти столбцовых объемов или CV буфера привязки.

Загрузите образец на колонку и соберите поток пробы, а затем используйте пять CV связующего буфера для промывки системы. Используйте пять CV элюирующего буфера для элюирования колонки с помощью изократического фракционирования. и собрать очищенные образцы антител в виде фракций с помощью сборщика фракций.

Наконец, уравновесьте систему пятью CV связующего буфера и соберите поток в контейнер для отходов. После завершения настройки метода укажите объем кондиционированной среды, который будет применен к столбцу, и сохраните метод.

Затем погрузите трубку насоса для отбора проб в сосуд, содержащий кондиционированную среду. Затем подготовьте отдельную емкость для сбора потока проб через указанную выходную трубку. Вставьте сборные пробирки в коллектор фракций и добавьте нейтрализационный буфер в каждую сборную пробирку. В модуле управления системой программного обеспечения откройте метод, который будет использоваться. Затем нажмите кнопку Пуск, чтобы начать выполнение.

Когда очистка будет завершена и модуль оценки, проверьте полученную хроматограмму. Соедините все белоксодержащие фракции в пробирку, а затем используйте PBS и центробежное фильтрующее устройство с отсечкой в 30 килодальтон для концентрации образца и проведения буферной замены. Наконец, используйте анализ BCA для измерения концентрации антител в соответствии с инструкциями производителя.