Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 4:18 мин. • July 8th, 2025
Возьмем срез мозга мыши, состоящий из зубчатой извилины гиппокампа, участка нейрогенеза, состоящего из предшественников нейронов на различных стадиях дифференцировки.
Переведите секцию в раствор, блокирующий пермеабилизацию. Молекулы детергента в растворе проникают в клетки, в то время как белки блокируют неспецифические сайты связывания.
Добавьте первичный коктейль антител, нацеленный на специфические маркеры нейрогенеза, белок, ассоциированный с микротрубочками, и промежуточный филаментный белок.
Удалите несвязанные антитела. Введение различных меченых флуорофорами вторичных антител, связывающихся с первичными антителами.
Добавьте сывороточные белки из того же хозяина в качестве одного из первичных антител, насыщая паратопы вторичными антителами.
Вводите моновалентные Fab-фрагменты, которые насыщают эпитопы сывороточных белков, предотвращая неспецифическое связывание.
Добавьте второе первичное антитело, поднятое тем же хозяином, связываясь с другим промежуточным филаментным белком.
Введение меченых флуорофорами вторичных антител, нацеленных на второе первичное антитело.
С помощью флуоресцентной микроскопии определить подтипы нейронов-предшественников, экспрессирующие уникальные комбинации маркеров.
Начните с переноса секций из раствора антифриза в TBS с помощью тонкой щетки. Тщательно промойте секции, начиная с ночной стирки при температуре 4 градуса Цельсия, за которой последуют пять 10-минутных стирок при комнатной температуре. Все эти инкубации должны выполняться при непрерывном осторожном перемешивании.
Если один из представляющих интерес антигенов является аналогом тимидина, то на этом этапе необходимо провести стадию денатурации соляной кислотой, за которой следует стадия нейтрализации в боратном буфере. Продолжайте пермеабилизацию и блокирование неспецифических сайтов связывания антител при TBS-plus. Дайте такой инкубации идти в течение 1 часа при комнатной температуре.
Затем инкубируйте первое первичное антитело, разведенное в TBS-plus, в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день промойте срезы три раза в TBS, и один раз в TBS-T. Дайте каждой ванне постоять 10 минут. Затем инкубируйте в первом вторичном антителе, конъюгированном с флуорохромом, в течение трех часов при комнатной температуре. С этого момента защищайте секции от воздействия света.
После еще одной серии промывки перенесите срезы в 10% раствор сыворотки видов-хозяина, из которого были изготовлены два первичных антитела. Инкубируйте срезы в этом растворе в течение трех часов, чтобы насытить открытые паратопы на первом вторичном антителе. Позже смойте три раза в TBS, и один раз в TBS-T, чтобы удалить сыворотку.
Затем приготовьте раствор TBS-plus с концентрацией 50 мкг на миллилитр неконъюгированных моновалентных Fab-фрагментов, направленных против хозяина вида первичного антитела. Он охватывает эпитопы, которые в противном случае могли бы быть распознаны вторым вторичным антителом. Переложите срезы в этот раствор и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.
После инкубации срезы промыть не менее трех раз в TBS, и один раз в TBS-T. Во время переноса смажьте сетчатые вставки, содержащие срезы, на бумажное полотенце, чтобы удалить остатки Fab. Теперь инкубируйте срезы второго первичного антитела в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.
После очередной серии полоскания нанесите второе вторичное антитело на три часа при комнатной температуре. Наконец, промойте срезы три раза в TBS и приступайте к монтажу срезов в желатине. Высушите слайды на воздухе и защитите их с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание.