Методика иммуномечения для визуализации субклеточной локализации белков

Начните с промывания неподвижного участка сердца в буфере из какодилата натрия, который стабилизирует структуру ткани. Погрузите срез в тетраоксид осмия, чтобы окрашивать липиды мембраны.

Обработайте ацетатом натрия для поддержания оптимального pH для окрашивания.

Добавляйте уранилацетат для окрашивания биомолекул, обеспечивая лучший контраст во время микроскопии.

Обезвоживайте ткани в возрастающих концентрациях этанола с последующим добавлением ацетона.

Погрузите ткань в смолу, получите ультратонкие срезы и перенесите их на сетку для микроскопии.

Введите метакарбонат натрия для удаления тетраоксида осмия, демаскирующего клеточный белок.

Соединение также окисляет гликопротеин, образуя реактивные альдегидные группы, которые нейтрализуются обработкой глицином.

Введите блокирующий буфер, предотвращающий связывание неспецифических антител.

Добавьте первичные антитела, специфичные к белку-мишени, а затем биотинилированные вторичные антитела.

Добавьте стрептавидин-конъюгированные квантовые точки, которые связываются с биотином.

Под электронным микроскопом области, меченные квантовыми точками, демонстрируют более высокий контраст, способствуя точной субклеточной локализации целевого белка.

После 24 часов фиксации промойте ткань в 0,1 молярном буфере какодилата натрия дважды в течение 20 минут. Извлеките ткань из буфера какодилата натрия и погрузите в 2% раствор тетраоксида осмия на 4 часа при комнатной температуре.

После осмикации погрузите ткань в 2% раствор ацетата натрия на 10 минут при комнатной температуре. Далее погрузите ткань в 2% раствор уранилацетата на 1 час при комнатной температуре. После окрашивания уранилацетатом последовательно обезвоживайте ткань с помощью градуированных спиртов и ацетона.

Погрузите обезвоженную ткань в эпоксидную смолу с низкой вязкостью, как описано в рукописи. Поместите ткань в свежую смолу в 8-миллиметровые микроформы, формы и затвердейте встроенную ткань при температуре 70 градусов Цельсия в течение ночи. Найдя интересующую область с помощью ультра 45-градусного ножа, изготовьте ультратонкие срезы бледного золота. Поместите эти ультратонкие секции на тусклую сторону медной сетки 200 меш.

Начните окрашивание с демаскировки антигена, нанеся 20 микролитров протравливающего раствора метапериодата натрия на чистую парафиновую пленку. Высохшую сетку с тканевыми срезами выложите на каплю протравливающего раствора. Оставьте сетку сечения на растворе на 30 минут при комнатной температуре. Промойте протравленные срезы ткани, поместив их на каплю дистиллированной воды на 60 секунд.

Заблокируйте остаточные альдегиды, поместив сетку сечения на каплю 0,05 молярного раствора глицина на 10 минут при комнатной температуре. Промокните края сетки на фильтровальной бумаге, чтобы удалить остатки раствора глицина. Поместите сетку секции в 10-20 микролитров блокирующего раствора на 25 минут при комнатной температуре.

Промокните края сетки на фильтровальной бумаге и поместите срезы сетки на разбавитель антител для кондиционирования при комнатной температуре на 10 минут. Инкубируйте срезы сетки с первичным антителом в течение 1 часа 30 минут во увлажненной камере. Промокните сетку насухо и промойте участки сетки разбавителем антител дважды по 5 минут каждая.

Инкубировать срезы сетки с биотинилированными вторичными антителами в течение 1 часа во увлажненной камере. После того, как сетка высохнет, промойте секции сетки разбавителем антител дважды по 5 минут каждая. Инкубируйте секции сетки в коммерчески доступных стрептавидин-конъюгированных QD в течение 1 часа во увлажненной камере при комнатной температуре. Не допускайте попадания света, накрыв камеру алюминиевой фольгой. После просушки краев сетки с помощью фильтровальной бумаги промойте секции сетки, поместив их на капли воды на две минуты, и промокните края сетки для высыхания.