Методика окрашивания органа цельного крепления для трехмерной визуализации почки

Возьмите неподвижную почку мыши. Липиды в тканях вызывают рассеяние света, а пигменты вызывают поглощение света, делая клетки непрозрачными.

Обработайте ткань препаратом CUBIC-L для удаления липидации и обесцвечивания. Аминоспирт в CUBIC-L удаляет липиды и пигменты, сводя к минимуму рассеяние света и повышая прозрачность.

Молекулы детергента в CUBIC-L также проникают в клетки.

Введение первичного коктейля антител, который связывается с цитоплазматической тирозингидроксилазой в нейронах симпатических нервов и альфа-гладкомышечным актином в гладкомышечных клетках сосудов.

Добавьте меченные флуорофорами вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами.

Выполните постфиксацию тканей для сохранения лечения антителами.

Погрузите ткань в CUBIC-R+, который заменяет воду и соответствует показателю преломления белков, что еще больше минимизирует рассеяние света и повышает прозрачность.

Под световым флуоресцентным микроскопом световые листы освещают ткани, возбуждая флуорофоры.

Захватите свет, излучаемый флуорофором, и реконструируйте трехмерное изображение, отображающее распределение симпатических нервов вокруг артерий в почке.

Для начала сразу после перфузионной фиксации и забора проб почки необходимо провести иммерсионную фиксацию, погрузив почку в 4% параформальдегид при температуре 4 градуса Цельсия на 16 часов. Сделайте три мытья с помощью PBS в течение двух часов каждое. Выполните процесс обесцвечивания и делипидирования, погрузив неподвижную почку в семь миллилитров 50% CUBIC-L в 14-миллилитровую пробирку с круглым дном с легким встряхиванием при комнатной температуре.

Через шесть часов погрузите почку в семь миллилитров CUBIC-L в 14-миллиметровую трубку с круглым дном с легким встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия на пять дней. Обновляйте CUBIC-L каждый день. После того, как обесцвечивание и удаление липидации будут завершены, используйте дозирующую ложку для работы с образцом и трижды промойте почку PBS при комнатной температуре в течение двух часов.

Иммуноокрашивание делипированной почки в первичные антитела разводят в окрашивающем буферном растворе с легким встряхиванием в инкубационном шейкере при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи дней. Затем промойте почку 0,5% Triton X-100 в PBS, также известном как PBST, при комнатной температуре в течение одного дня. Для окрашивания вторичными антителами обработайте почку вторичными антителами в буфере для окрашивания в темноте с легким встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи дней. Зафиксируйте пятно с помощью ПБСТ смывки при комнатной температуре на одни сутки.

После фиксации погрузите почку в 1% формальдегид в ПБ на три часа и промойте ее ПБС при комнатной температуре в течение шести часов. Выполните согласование показателя преломления путем погружения почки в семь миллилитров 50% CUBIC-R+ в 14-миллилитровую пробирку с круглым дном с встряхиванием в течение одного дня, с последующим лечением семью миллилитрами CUBIC-R+ с встряхиванием при комнатной температуре в течение двух дней.