Иммунофлуоресцентный анализ для выявления агрегатов альфа-синуклеина в биопсийном срезе кожи

Возьмем, к примеру, криосекцию биопсии кожи пациента с болезнью Паркинсона, заключенного в закладную среду.

Ткань состоит из наружного эпидермиса, нижележащей дермы и подкожного жира, иннервируемого нервами.

Промойте секцию, чтобы удалить закладную среду. Перенесите его в раствор, блокирующий пермеабилизацию, проникая в клетки и блокируя неспецифические сайты связывания.

Погрузите срез в первичный коктейль антител для достижения равномерного мечения антител, называемого свободно плавающим окрашиванием.

Антитела проникают в нейроны и связываются с альфа-синуклеиновыми агрегатами, распределенными по аксонам — агрегированной формой, характерной для нейродегенеративных заболеваний, — и карбоксил-концевыми гидролазами.

Введение флуорофор-конъюгированных вторичных антител, которые связываются с первичными антителами.

Обработайте флуоресцентным ДНК-связывающим красителем, который окрашивает ядро.

Поместите салфетку на предметное стекло, нанесите монтажную среду и запечатайте покровным стеклом.

Под конфокальным микроскопом флуоресценция обоих антител выявляет наличие агрегатов альфа-синуклеина вдоль аксонов дермальных нейронов.

Для начала заполните некоторые лунки свежей 96-луночной пластины 100 микролитрами моющего раствора. Перенесите анализируемые срезы из накопительной пластины в пластину, содержащую моющий раствор. Оставьте секции в моющем растворе на 10 минут при комнатной температуре. Затем переложите каждую секцию в пустую лунку, содержащую тот же раствор для стирки, и повторите промывку. Далее добавьте на срезы промывочный раствор, и переложите их в новые лунки, содержащие 100 микролитров блокирующего раствора. Инкубировать при комнатной температуре не менее 90 минут и максимум 4 часа.

Разведите в рабочем растворе первичные антитела, анти-PGP9,5 и анти-5G4. Переложите срезы в новые лунки, содержащие 100 микролитров рабочего раствора первичных антител и инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре.

На следующий день промойте срезы в лунках, содержащих промывочный раствор, как описано ранее. Разведите вторичные антитела - козий антикролик для обнаружения анти-PGP9.5 и козий анти-мышиный для обнаружения 5G4 в рабочем растворе.

Переложите промытые срезы в новые лунки, содержащие 100 микролитров рабочего раствора вторичных антител. Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы избежать отбеливания флуорофора, конъюгированного со вторичными антителами, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 90 минут.

После этого промойте срезы два раза в моющем растворе, как описано ранее. Переложите промытые срезы в новые лунки, содержащие 100 микролитров DAPI, на 5 минут при комнатной температуре. Промойте срезы два раза в моющем растворе, как описано ранее. Затем установите секции на слайд в правильном положении, не допуская неправильного складывания.

Добавьте несколько капель монтажного средства на предметное стекло и накройте секцию покровным стеклом. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи. На следующий день храните предметные стекла в соответствующей коробке при температуре 4 градуса Цельсия, стараясь избегать воздействия света.

С помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа просмотрите срезы. Получайте изображения с помощью камеры, подключенной к микроскопу. Затем с помощью флуоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа проанализируйте положительные сигналы в срезах с точки зрения пространственного распределения и интенсивности сигнала, как указано в текстовом протоколе.