Обнаружение циркулирующих антигликановых антител с помощью печатной гликановой матрицы

Начните с функционализированного гликочипа с напечатанными гликановыми субмассивами, организованными в блоки массивов.

Каждое пятно в подматрице представляет собой отдельный гликан — полимер на основе углеводов с вариациями в составе моносахаридов, длине цепи и характере ветвления.

Обработайте гликочип блокирующим буфером для блокировки неспецифических сайтов взаимодействия.

Перенесите гликочип и введите разведенную сыворотку мыши в буфер с добавкой сурфактанта, чтобы свести к минимуму агрегацию антител. Инкубируйте при перемешивании.

Перемешивание способствует равномерному распределению сыворотки крови, способствуя избирательному связыванию антигликановых антител со специфическими гликанами на основе различных молекулярных характеристик.

Промыть с уменьшающейся концентрацией буфера, содержащего поверхностно-активное вещество, для нарушения неспецифического связывания и смыть.

Наложите на гликочип вторичные антитела, конъюгированные с биотином мыши, взаимодействуя с предварительно связанными антигликановыми антителами, и промойте.

Ввести меченный флуорофорами стрептавидин, связывающийся с биотинилированными вторичными антителами. Промойте и удалите излишки раствора.

Отсканируйте гликочип и наблюдайте за отчетливыми флуоресцентными пятнами в различных положениях, указывающими на гликан-специфические циркулирующие антитела в сыворотке.

Подготовьте буфер #1 через буфер #4, как описано в текстовом протоколе. Чтобы подготовить гликочипы и образцы, поставьте ящик для хранения со слайдами на стол до тех пор, пока они не достигнут комнатной температуры. Откройте коробку и перенесите гликочип в инкубационную камеру, которая должна быть уже кондиционирована влажной фильтровальной бумагой, чтобы поддерживать постоянную влажность внутри камеры.

Тем временем разведите мышиную сыворотку с буфером 1 в 1,5-миллилитровых пробирках. Гомогенизируйте раствор сыворотки в течение 5 секунд с помощью вихревого смесителя. После гомогенизации разведенную сыворотку инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут на водяной бане, чтобы избежать агрегации иммуноглобулинов. Затем центрифугируйте пробирки в течение 3 минут при температуре 10 000 раз больше g и 25 градусов Цельсия.

Соберите надосадочную жидкость и выбросьте выпавший в осадок материал. Осторожно поместите гликочип в инкубационную камеру. Инкубируйте его с 1 миллилитром буфера #3, чтобы удалить любые остатки материала на поверхности гликочипа. В течение 15 минут при температуре 25 градусов Цельсия удерживайте гликочип в вертикальном положении и повторно промойте его несколькими каплями буфера #3 с помощью пластиковой пипетки Пастера.

Затем осторожно удалите буфер с поверхности гликочипа с помощью фильтровальной бумаги. Поместите гликочип обратно в инкубационную камеру. Распределите разведенный образец сыворотки по поверхности гликочипа с помощью микропипетки. Убедитесь, что все сухие участки поверхности гликочипа покрыты разбавленным образцом сыворотки с помощью кончика пипетки.

Инкубировать с орбитальным возбуждением при 37 градусах Цельсия в течение 1 и 1/2 часов. После инкубации удалите лишний образец и погрузите гликочип на 5 минут в буфер #3 при температуре 25 градусов Цельсия. Поместите гликочип в емкость с буфером #4, и, наконец, промойте гликочип сверхчистой водой.

Центрифугируйте гликочип в течение 1 минуты при 175-кратном g и 25 градусах Цельсия, чтобы удалить жидкость. После помещения гликочипа обратно в инкубационную камеру распределите по поверхности гликочипа раствор козьего антимышиного препарата, конъюгированного с биотином. Инкубировать с орбитальным возбуждением при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Удалите несвязанную фракцию и повторите шаги промывки.

После центрифугирования инкубируйте гликочип в темноте при температуре 25 градусов Цельсия в течение 45 минут с концентрированием 2 микрограмма на миллилитр соответствующего раствора стрептавидина, меченного флуорохромом, в буфере #2. После работы в темноте, чтобы удалить несвязанную фракцию и повторения этапов промывки, высушите гликочип на воздухе.

Чтобы отсканировать матрицу, оставьте гликочип на столе до тех пор, пока он не достигнет комнатной температуры в темноте. Одновременно включите сканер слайдов и лазер. Удерживая микрочип, вставьте гликочип в паз до тех пор, пока он не коснется задней панели. Отсканируйте гликочип, запустив программу Easy Scan, и сохраните сканирование в виде файла .tiff.