Иммунолокализация белков и пектинов арабиногалактана в тканях растений

Возьмите предметное стекло с реакционными лунками, содержащими тонкие срезы различных растительных тканей. Ткани фиксируются и помещаются внутрь смолы для иммуноокрашивания.

Поместите предметное стекло в темную и влажную инкубационную камеру, чтобы предотвратить воздействие света и испарение реагента на последующих этапах.

Введите блокирующий раствор для предотвращения взаимодействия неспецифических антител.

Промойте, чтобы удалить излишки блокирующего раствора, затем добавьте антиген-специфические первичные антитела и инкубируйте.

Антитела связываются со своими целевыми антигенами, а именно белками арабиногалактана и пектинами в клеточной стенке.

Вводят флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела, и нанесите флуоресцентный краситель, который связывается с целлюлозой, маркируя клеточную стенку.

Добавьте монтажный носитель и запечатайте покровным стеклом.

Под микроскопом флуоресценция красителя и связанных антител помогает визуализировать целлюлозу в клеточных стенках растений, колокализованную с арабиногалактановыми белками или пектином, демонстрируя их тканеспецифическое распределение.

Чтобы подготовить инкубационную камеру для реакционных стекол, положите на дно коробки с наконечниками для пипеток несколько смоченных бумажных полотенец и оберните коробку алюминиевой фольгой. Перенесите предметные стекла из коробки в инкубационную камеру. Пипеткой внесите 50 микролитров блокирующего раствора в каждую лунку. После инкубации предметного стекла в течение 10 минут удалите блокирующий раствор. Затем каждый раз дважды промойте все лунки PBS в течение 10 минут. После приготовления первичных растворов антител, как описано в рукописи, выполните окончательную промывку лунок дистиллированной, деионизированной водой в течение 5 минут.

Пипеткой введите первичный раствор антитела в реакционные лунки. Затем нанесите пипетку блокирующего раствора в контрольные лунки. Закройте инкубационную камеру. Дайте ему постоять два часа при комнатной температуре, а затем поставьте в холодильник на ночь при температуре 4 градуса Цельсия. Приготовьте 1% раствор вторичного антитела в блокирующем растворе. Примерно 40 микролитров на лунку понадобится

.

Накройте раствор алюминиевой фольгой. Промыть лунки реакционной горки дважды PBS, и один раз дистиллированной, деионизированной водой в течение 10 минут каждый раз. Убедитесь, что в скважинах не осталось засоряющего раствора или отложений. Пипеткой нанесите вторичный раствор антитела во все лунки. Высиживайте предметные стекла в темноте при комнатной температуре в течение 3-4 часов.

Снова промойте лунки реакционного предметного стекла дважды PBS, и один раз дистиллированной, деионизированной водой. Затем добавьте в каждую лунку по капле калькофтор-белил. Не промывая, добавьте каплю монтажного средства в каждую лунку и накройте каждую лунку покровным стеклом. Рассмотрите срезы образца на предметном стекле с помощью флуоресцентного микроскопа.

Для каждого наблюдения используйте УФ-фильтр для обнаружения клеточных стенок, окрашенных калькофтором, и фильтр FITC для обнаружения иммунолокализации. Для лучшей визуализации результатов используйте ImageJ или аналогичную программу анализа изображений, чтобы объединить каждое изображение УФ-фильтра с соответствующим изображением фильтра FITC.