Использование сэндвич-ИФА для определения содержания иммуногенных гликопротеинов в вакцине

Начните с пассивированной тестовой пластины, покрытой антирабическими, иммуногенными гликопротеин-специфическими моноклональными антителами и блокатором для предотвращения неспецифических взаимодействий.

Вводить серийно разбавляемые референтные и испытывать вакцины против бешенства со сниженным содержанием гликопротеинов. Закройте пластину во избежание загрязнения.

Во время инкубации иммуногенные гликопротеины взаимодействуют с моноклональными антителами, покрытыми оболочкой, через специфический антигенный сайт.

После инкубации снимите пленку, аспирируйте надосадочную жидкость и промойте пластину.

Наложение на фермент-конъюгированные гликопротеин-специфические моноклональные антитела, которые связываются с другим антигенным сайтом на гликопротеине, образуя иммунокомплекс.

Добавьте раствор, содержащий субстрат и хромоген. Когда субстрат взаимодействует с ферментом, он вызывает окисление хромогена, изменяя цвет раствора.

Добавьте останавливающий раствор для инактивации ферментов.

Измерьте абсорбцию и постройте референсную кривую с использованием эталонных значений вакцины.

Определите область, в которой существует линейная зависимость между абсорбцией и содержанием гликопротеинов в референтных вакцинных разведениях. Затем экстраполируйте содержание гликопротеинов в разведениях исследуемой вакцины на основе абсорбции, которая попадает в эту область.

Чтобы промыть лезвие, добавьте в каждую лунку по 300 микролитров промывочного буфера. Затем тщательно отсадите и перенесите содержимое лунки в реципиент, содержащий раствор 2,6% гипохлорита натрия. Повторите этот процесс промывки еще пять раз, чтобы обильно промыть сенсибилизированную пластину.

После этого переверните микропланшет, и дайте ему высохнуть на листе впитывающей бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты. Восстановите референтную вакцину в одном миллилитре дистиллированной воды таким образом, чтобы конечная концентрация гликопротеина вируса бешенства составила 10 микрограммов на миллилитр. Приготовьте 10-кратное разведение восстановленной референтной вакцины в разбавителе до концентрации гликопротеина вируса бешенства в один микрограмм на миллилитр.

Затем выполните шесть последовательных двойных разведений этой референтной вакцины в разбавителе, как указано в таблице 1 текстового протокола. Распределите 200 микролитров разбавителя в дублирующих лунках, которые будут служить пустым контролем, и 200 микролитров на лунку на каждую референтную вакцину в двух экземплярах.

Затем приготовьте 10-кратное разведение испытуемой вакцины в разбавителе и семь двукратных серийных разведений испытуемой вакцины в разбавителе, как указано в таблице 2 текстового протокола. Распределите по 200 микролитров каждого испытуемого вакцинного разведения в двух экземплярах на каждую лунку микропланшета. Накройте микропланшет клейкой пленкой, и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

После этого снимите пленку, осторожно отасуньте и перенесите содержимое каждой лунки в реципиент, содержащий 2,7% раствор гипохлорита натрия. Чтобы вымыть пластину, добавьте в каждую лунку по 300 микролитров промывочного буфера. Осторожно отсадите и перенесите содержимое каждой лунки в реципиент, содержащий 2,6% раствор гипохлорита натрия.

Повторите процесс промывки еще пять раз, чтобы удалить несвязанный антиген и сохранить тримеры G-белка, связанные с покрытым покрытием антителом. Переверните промытую микропластину, и дайте ей высохнуть на листе впитывающей бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты. Затем распределите 200 микролитров рекомендуемого разведения меченного пероксидазой моноклонального антитела D1 в разбавителе в каждую лунку.

Накройте микропланшет клейкой пленкой, и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем снимите пленку, осторожно отаспирируйте и перенесите содержимое каждой лунки в реципиент, содержащий 2,6% раствор гипохлорита натрия. Чтобы промыть микропластину, добавьте в каждую лунку по 300 микролитров промывочного буфера.

Осторожно отсадите и перенесите содержимое каждой лунки в реципиент, содержащий 2,6% раствор гипохлорита натрия. Повторите этот процесс промывания еще пять раз, чтобы удалить несвязанное антитело, меченное пероксидазой. Переверните микропланшет для стирки и дайте ему высохнуть на листе впитывающей бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты.

Далее распределите по 200 микролитров раствора хромогена субстрата в каждую лунку. Запечатайте микропланшет пленкой, и выдерживайте при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Затем добавьте по 50 микролитров останавливающего раствора в каждую лунку, чтобы остановить реакцию.

Осторожно протрите нижнюю часть микролезвия, и поместите его в спектрофотометр. Определите оптическую плотность на уровне 492 нанометров для всех используемых скважин. Соберите эти данные в файл электронной таблицы для анализа. После этого создайте графики как для эталонной кривой вакцины, так и для значений оптической плотности, как указано в текстовом протоколе.