Иммунозахват и проточная цитометрия внеклеточных везикул для определения антигенных характеристик

Начнем с трубки, несущей связанные с клетками мембранные частицы, называемые внеклеточными везикулами, или ВВ, которые демонстрируют уникальные антигенные композиции.

Введение магнитных наночастиц (MNP), содержащих антитела захвата, конъюгированные с флуоресцентно меченными Fab-фрагментами.

Инкубируются для облегчения взаимодействия между МНП со специфическими антигенами ВВ, образуя комплексы МНП-ЕВ.

Добавьте иммуноглобулин-G для блокирования сайтов связывания Fc, затем введите флуоресцентно меченые антитела для обнаружения для окрашивания других антигенов на захваченных частицах.

Загрузите эту смесь на предварительно промытую магнитную колонку, помещенную в магнитный сепаратор.

Магнитное поле удерживает захваченные MNP частицы внутри колонны. Замените буфер для удаления несвязанных антител.

Извлеките колонку из магнитного сепаратора, элюируйте захваченные MNP частицы с помощью буфера и зафиксируйте их для сохранения структурной целостности.

Анализируйте иммунозахваченные частицы с помощью проточной цитометрии; отчетливые сигналы флуоресценции от окрашенных антигенов коррелируют с уникальными антигенными характеристиками ВВ.

Начните с объединения 60 микролитров MNP для каждого условия и 5 микролитров меченых Fab-фрагментов, специфичных для изотипа интересующего вас антитела захвата, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра. Инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 30 минут при непрерывном перемешивании. Затем предварительно смочите концентратор 100k 300 микролитрами PBS и вращайте концентратор в микроцентрифуге.

По окончании центрифугирования очистить меченые комплексы на колонке 100к с последующим еще одним центрифугированием, суспендируя гранулу в 200 микролитрах свежей PBS. Для захвата представляющих интерес частиц инкубируйте меченные антителами MNP с интересующей частицей в течение соответствующего инкубационного периода и температуры.

Затем заблокируйте любое неспецифическое связывание ФК с соответствующими видами антител IgG, осторожно сделайте вихрь и инкубируйте раствор частиц в течение 3-5 минут при комнатной температуре. Затем добавьте рекомендованную производителем концентрацию каждого антитела к частицам или контрольные антитела изотипа к контрольному образцу изотипа в течение дополнительных 20 минут инкубации при комнатной температуре.

Чтобы отделить захваченные MNP частицы от несвязанного антитела, сначала поместите магнитную разделительную колонку в магнит-сепаратор и предварительно смочите колонку 500 микролитрами промывочного буфера. Дайте буферу для промывки протечь через колонну. Затем добавьте в колонну комплексы частиц MNP, собирая проточные потоки в контейнер для отходов.

Когда весь сложный раствор пройдет через колонну, промойте колонку три раза 500 микролитрами промывочного буфера. Затем переложите колонку в трубу размером 12 на 75 миллиметров. Через три минуты добавьте 200 микролитров PBS, позволяя бусинам размываться под действием силы тяжести.

Когда весь PBS пройдет через колонку, добавьте в пробирку 200 микролитров свежего PBS и зафиксируйте частицы 200 микролитрами 4% параформальдегида. Затем загрузите PBS, отфильтрованный 0,22 микрона, в проточный цитометр и отрегулируйте напряжение PMT на цитометре до тех пор, пока отфильтрованный PBS не покажет ноль или очень мало событий. Затем пропустите захваченные MNP частицы с использованием низкого потока с помощью встроенного фильтра 0,04 микрона для жидкости оболочки, размещенного последовательно за стандартным фильтром оболочки 0,2 микрона, чтобы еще больше исключить любые ложные события.