Органотипической коллагена I Анализ: ковкий платформы для оценки сотовый Поведение в 3-мерной Контекст

Общая цель этой процедуры заключается в создании трехмерной коллагеновой матрицы для изучения функции клеток. Это достигается путем предварительного извлечения коллагена из сухожилий крысиного хвоста. Затем коллагеновые волокна восстанавливаются в присутствии фибробластов, чтобы позволить фибробластам сокращать коллагеновый гель.

На третьем этапе опухолевые клетки рассаживаются поверх матрицы на последнем этапе. Матрикс инкубируется на металлической сетке для создания воздушно-жидкостной границы, позволяющей проникать опухолевым клеткам в матрикс. В конечном счете, иммуногистохимическое окрашивание и флуоресцентная микроскопия могут быть выполнены для анализа миграции клеток матриксного синтеза, включая инвазию опухолевых клеток и взаимодействие между различными типами клеток.

Таким образом, этот метод идеально подходит для изучения инвазии и метастазирования, а также для изучения развития опухоли. На сложном трехмерном S мы можем рассмотреть такие вещи, как дифференцировка, выживание клеток и их рост. Но, в частности, мы можем рассмотреть, как опухолевые клетки взаимодействуют со стромой во время ключевых событий инвазии.

Одним из самых ранних этапов метастазирования рака является создание культур фибробластов из кожных имплантатов. Сначала положите несколько капель МЕМ с добавлением пенициллина, стрептомицина и грибов зоны на дно чашки Петри. Затем поместите в чашку биопсию с помощью четырехмиллиметрового пунша, полученную из предплечья человека.

Затем, наконец, разрежьте биопсию на мелкие кусочки, покачивая лезвием скальпеля номер 24 на дне чашки Петри. Поместите тканевую суспензию в колбу для культуры тканей площадью 25 квадратных сантиметров. Затем налейте на ткани первичную питательную среду фибробластов.

Этого достаточно, чтобы покрыть поверхность колбы, но этого недостаточно для того, чтобы ткань всплыла. Инкубируйте колбу в течение трех дней при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с содержанием 5% CO2, а затем добавьте три миллилитра первичной питательной среды для фибробласта еще через три дня. Инкубация. Замените среду на свежую первичную среду для роста фиброструйной обработки.

Если клетки почти сливаются, их можно разделить по одной-четыре на новые колбы со свежей средой. Начните с мытья крысиных хвостов в 70% этаноле охладите бутылку с 0,5 молярной уксусной кислотой при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить сухожилия из крысиных хвостов. Во-первых, снимите кожу с каждого отдельного крысиного хвоста.

Далее отделите сухожилие от сердцевины проксимальной области хвоста. Наконец, удалите сухожилие по направлению к дистальной области хвоста с помощью зубных щипцов. После того как сухожилия будут удалены, добавьте в стеклянную коническую колбу 250 миллилитров 0,5 молярной уксусной кислоты.

Извлеките один грамм сухожилия на 250 миллилитров кислоты, перемешивая при температуре четыре градуса Цельсия в течение 48 часов после извлечения сухожилия. Центрифугируйте раствор кислоты и сухожилий при 7,500 умноженных на G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, а затем выбросьте гранулы. Затем добавьте равный объем 10% от веса на объем NACL в надосадочную жидкость и перемешивайте еще 30-60 минут после второго этапа перемешивания.

Гранулируйте раствор. На этот раз при 10 000 G выбросьте надосадочную жидкость и красным растворите осадок в 0,25 молярной уксусной кислоты при большем перемешивании в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия. Затем диализируйте коллагеновый раствор против шести-восьми изменений по шесть литров примерно 17,5 миллимолярной уксусной кислоты.

После диализа гранулы коллагена в 30 000 раз больше G в течение 1,5 часов. Наконец, перелейте наднатин в стерильную бутылку и отрегулируйте концентрацию коллагена примерно до двух миллиграммов на миллилитр с предварительно охлажденной 0,5 миллимолярной уксусной кислотой, а затем держите коллаген на льду. Сначала выберите три колбы T 75 с конфлюентными первичными фибробластами.

Поставьте емкость с FCS на четыре градуса Цельсия для остывания. Далее добавьте 75 миллилитров ранее приготовленного коллагена крысиного хвоста в 100-миллилитровую стеклянную предварительно охлажденную стерильную бутылку. Затем добавьте девять миллилитров 10 XMEM, помешивая смесь.

Добавьте шесть миллилитров 0,22 нормального гидроксида натрия, замедляя при приближении к последнему миллилитру. Чтобы убедиться, что конечный цвет находится между оранжевым и розовым. Трипсин просматривает фибробласты, а затем гранулирует клетки в 400 раз больше G в течение пяти минут при комнатной температуре.

Во время отжима соберите 36 35-миллиметровых пластиковых тарелок. Ресуспендируйте гранулу в 10 миллилитрах предварительно охлажденной ССК и немедленно добавьте фибробласты к коллагену. Смешайте и перемешайте тарелку примерно 2,5 миллилитров добавки коллагеновых фибробластов на 35-миллиметровую посуду как можно быстрее.

Предотвращение образования пузырьков и закрепления коллагена. Поместите посуду в инкубатор на 10 минут, чтобы коллаген смог образовать рыхлый гель, а затем добавьте по одному миллилитру питательной среды fiberblast в каждую посуду. Затем отсоедините матрицу коллагенового волокна от стенок чашки, с помощью пипетки поместите посуду обратно в инкубатор.

На следующий день добавьте в посуду еще один миллилитр питательной среды Fiberblast. Затем меняйте носители через день в течение следующих восьми дней. В течение этого времени каждая матрица коллагеновых фибробластов должна сократиться примерно с 3,5 сантиметров до примерно 1,5 сантиметров в диаметре, прежде чем начать следующий шаг, стерилизовать все щипцы и оборудование этанолом.

Затем с помощью тупых стерилизованных щипцов аккуратно переместите сжатую матрицу в лунку 24-луночной пластины, следя за тем, чтобы матрица не складывалась. Далее выберите колбу с изучаемыми клетками, триппсом ножами и окатываем клетки, как и раньше, а затем повторно суспендируйте клетки в медиа-тарелке одним миллилитром клеточной суспензии поверх матрицы и поместите сжатую матрицу в инкубатор до тех пор, пока клетки не вырастут почти до слияния до вершины матрицы. Примерно через три-пять дней после автоклавирования предварительно вырезанные решетки из нержавеющей стали для создания штативов перед использованием места, стерильной сетки в шестисантиметровую пластиковую посуду добавляют достаточное количество питательной среды, чтобы покрыть сетку.

Создание границы раздела воздушной жидкости является самой деликатной частью этой процедуры. Матрица должна быть помещена на решетку, а затем осторожно отсасывать эту среду таким образом, чтобы матрица все еще была частично погружена снизу и подавалась снизу. Это создает хемотаксический градиент и позволяет клеткам сверху начать вторжение в матрицу.

Поведение клеток в этой конфигурации можно оценить в течение 21 дня или более. Поместите матрицу на сетку. Затем аккуратно отсасывайте среду до тех пор, пока нижняя часть матрицы не будет соприкасаться с ней, но не будет закрыта ею.

Тогда интерфейс воздушной жидкости должен выглядеть примерно так, как показано в этой сцене. Далее перенесите инфильтрированную матрицу на плоскую поверхность. Разрежьте матрицу пополам свежим скальпелем, а затем поднимите матрицу скальпелем и перенесите ее на 4% PFA.

Зафиксировайте матрицу на ночь при комнатной температуре На следующих двух рисунках клетки протоковой аденокарциномы поджелудочной железы или клетки P DAC были наложены слоями на органотипическую матрицу. На первом рисунке неинвазивные P-клетки P dac можно увидеть в слое поверх матрицы, в то время как на втором рисунке здесь наблюдаются инвазивные P-клетки, которые проникли в матрикс, здесь можно увидеть живой эквивалент кожи, показывающий стратифицированный эпидермис на коллагеновом дермальном компоненте, сокращенном фибробластами. Инвазивные клетки PD зеленого цвета взаимодействуют с фибробластами красного цвета, что способствует вторжению PDX-клеток в органотипический матрикс.

Инвазивные клетки БП, показанные здесь снова зеленым цветом, визуализируются внутри коллагенового матрикса, который визуализируется с использованием генерации второй гармоники, и показаны фиолетовыми участками деградации матрикса, видимыми в виде темных дыр внутри фиолетового матрикса. На этом рисунке C 8 1 61 показаны клетки меланомы, вторгающиеся в фибробласты в сокращенный коллагеновый дермальный эквивалент, а также рассмотрено поведение основных процессов флуоресцентных белков во время этого анализа. Вы также можете использовать этот тест вместе с иммуногистохимическим окрашиванием для изучения маркеров пролиферации клеток и различий в выживаемости клеток и так далее.