Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 3:39 мин. • July 8th, 2025
Возьмем многолуночный планшет, содержащий клетки млекопитающих, инкапсулированные в гидрогелевую систему, имитирующую естественную среду внеклеточного матрикса.
Удалите питательную среду. Обработайте фиксирующим буфером для сшивания белков, сохраняя клеточную целостность.
Добавьте раствор, содержащий моющее средство, чтобы проникнуть в клеточную мембрану.
Вводите блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител на последующих этапах.
Добавьте первичный коктейль антител, который проникает в клетки и специфически связывается с цитоплазматическими промежуточными филаментами и целевым транскрипционным фактором.
Удалите несвязанные антитела. Введите флуоресцентно меченные вторичные антитела и ядерный краситель для флуоресцентного мечения ДНК.
Удалите несвязанные молекулы.
Закрепите гидрогелевую культуру на предметном стекле с помощью монтажного материала.
Используйте конфокальный микроскоп для наблюдения за иммуноокрашенными клетками.
Сначала отсасывайте среду из каждой лунки. Затем промойте лунки 1 миллилитром теплого DPBS. После того, как промывка будет завершена, добавьте в каждую лунку по 750 микролитров раствора для фиксации. Затем инкубируйте 24-луночный планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации отсасывайте раствор фиксации из каждой лунки, а фиксатор выбрасывайте в контейнер для опасных отходов. Далее добавьте в образец 1 миллилитр DPBS и немедленно выбросьте DPBS в контейнер для опасных отходов.
Далее добавьте 750 микролитров раствора для проникновения образца в течение одного часа при комнатной температуре на коромысле, со скоростью 15 оборотов в минуту. Через час отсадите раствор для пермеабилизации, и добавьте к образцу 750 микролитров блокирующего раствора. Оставьте образец на коромысле при комнатной температуре на три часа. Затем разведите желаемые первичные антитела раствором для разведения антител.
Далее добавьте по 500 микролитров раствора антитела в каждый образец. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день аспирируйте первичный раствор антитела. Затем промойте образцы PBST в течение одного часа трижды при комнатной температуре со скоростью 15 оборотов в минуту.
Затем разведите соответствующие вторичные антитела и 5 мг/мл стокового раствора DAPI до достижения конечной концентрации 2,5 мкг на миллилитр. Затем добавьте по 500 микролитров раствора в каждый образец. Затем используйте алюминиевую фольгу, чтобы накрыть 24-луночную пластину, и инкубируйте пластину при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи.
На следующий день отсасывайте вторичный раствор антитела и трижды промойте образцы с помощью PBST, каждый в течение 30 минут при комнатной температуре на качалке. Затем поместите каплю жестко застывшего монтажного материала на поверхность предметного стекла и поместите образец на монтажный материал. Наконец, используйте лак для ногтей, чтобы прикрепить образцы к предметному стеклу стеклянной крышки, чтобы предотвратить загрязнение или перемещение образца.