Оценка внутриклеточного распределения конъюгатов антител, модифицированных вирусными пептидами

Начните с приросших клеток эритробластов человека.

Введение вирусных модифицированных пептидами конъюгатов антител. Эти конъюгаты содержат последовательность ядерной локализации, или NLS, от вируса и остаток холевой кислоты.

Во время инкубации конъюгаты антител взаимодействуют с рецепторами клеточной поверхности и интернализуются в эндосомах.

Холевая кислота в конъюгате помогает выйти из эндосомального компартмента, способствуя внутриклеточному накоплению, в то время как транспортные белки и NLS способствуют их ядерной локализации.

Введите трипсин и ЭДТА-содержащий буфер для отделения клеток и удаления поверхностно связанных конъюгатов.

Добавьте среду, обогащенную сывороткой, для подавления активности трипсина.

Центрифуга для сбора клеток, их фиксация и пропитка.

Ввести дальний красный флуорофор меченный вторичные антитела, связывающиеся с локализованными конъюгатами и смывающие.

Обработайте ядерным красителем.

Наблюдайте под конфокальным микроскопом и получайте изображения на различных плоских глубинах.

После обработки изображения на клетке видны небольшие зеленые флуоресцентные очаги внутри цитоплазмы и ядра, подтверждающие внутриклеточное распределение конъюгатов антител.

Обрабатывайте клетки-мишени TF-1a 200 наномолярным конъюгатом 7G3-холевая кислота-антитело. Включают клетки, обработанные модифицированными контрольными моноклональными антителами. Инкубируйте 5 x 10⁶ антиген-положительных клеток с конъюгатами при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем удалите надосадочную жидкость и используйте один миллилитр ледяного PBS для промывания клеток три раза.

Добавьте свежую среду и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение дополнительного часа. Далее добавьте 0,5 миллилитра PBS, содержащего 0,25% трипсина и ЭДТА, и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем используйте 1,5 миллилитра среды RPMI-1640 с 10% FBS для нейтрализации трипсина.

Центрифугируйте клетки при 500 умноженных на g в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и используйте 0,5 миллилитра ледяного PBS, чтобы промыть клетки еще три раза. Добавьте в клетки 0,5 миллилитра 1% PFA и 1% сахарозы в PBS, и поместите их на лед на 30 минут для их фиксации.

Затем используйте 0,5 миллилитра ледяного PBS, чтобы промыть клетки три раза, и центрифугируйте образцы при 250-кратном g в течение пяти минут. Далее добавьте в клетки 0,15% Triton X-100 в PBS, и пропитайте их на льду в течение пяти минут. Затем с помощью ледяного PBS промойте клетки и повторите центрифугирование.

Суспендируйте клетки в 0,1 миллилитра PBS, содержащего два микрограмма на миллилитр вторичного поликлонального антитела против мышиной Fc, конъюгированного с AlexaFluor 647, и инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифугируйте клетки при 250 мг g в течение пяти минут и используйте 0,5 миллилитра ледяного PBS для трех промывки клеток.

Затем ресуспендируйте клетки в 0,5 миллилитрах PBS. Добавьте в клетки 10 микрограммов на миллилитр йодида пропидия. Затем используйте монтажный носитель для крепления 1 x 10⁵ ячеек на стеклянные предметные стекла, прежде чем накрыть образец стеклянным покровным стеклом. Исследуйте клетки с помощью масляного иммерсионного объектива Plan Apo 60X, числовая апертура 1,42, на инвертированном лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе.

Детектирование ПИ флуоресценции с помощью аргонового лазера с углом погружения 488 нм и спектральной сканирующей призмы с диапазоном от 600 до 650 нанометров. Для флуоресценции AF 647 используйте гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм и набор спектральных сканирующих призм для диапазона от 650 до 700 нанометров. Последовательный сбор изображений с камер P1 и AF 647 с разрешением 1024 x 1024 пикселей с 2-кратным усреднением по всей толщине ячейки. Представляйте изображения в виде проекций Z.

Чтобы проанализировать клетки, оценить и записать, является ли внутриклеточная флуоресценция в цитоплазме групповой и вблизи поверхности клетки или диффузной и однородной. Кроме того, оцените относительную интенсивность флуоресценции на одну клетку.