Методика in vitro для изучения трафика глутаматных рецепторов в нейронах гиппокампа
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 5:27 мин • July 8th, 2025
Возьмите три образца культур нейронов гиппокампа на покровных листах.
Введите первичные антитела для маркировки поверхностно экспрессируемых глутаматных рецепторов.
Добавьте кондиционированную среду ко второму и третьему образцам, чтобы индуцировать эндоцитоз рецепторов, связанных с антителами.
На третьем образце добавьте Fab-фрагменты для блокирования эпитопов на неэндоцитозированных антителах.
Введите ингибитор для блокирования эндоцитоза рецепторов, позволяя рецептору возвращаться на поверхность.
Во всех образцах зафиксируйте ячейки и добавьте блокирующий раствор, чтобы предотвратить неспецифическую маркировку.
Введение вторичных антител, меченных флуорофорами, для мечения первичных антител на поверхностно связанных рецепторах, включая рециркулированные.
Проникают в клеточные мембраны.
Добавьте первичное антитело снова к первому образцу, чтобы пометить ранее существовавшие эндоцитозные рецепторы.
Введите во все образцы другое вторичное антитело, помеченное флуорофорами, для маркировки первичных антител, связанных с эндоцитозированными рецепторами, различая эндоцитозированные и поверхностно связанные рецепторы.
Используя конфокальный микроскоп, количественно оцените поверхностно-экспрессированные, эндоцитозированные и переработанные рецепторы при различных методах лечения.
Чтобы начать эту процедуру, перенесите покровные стекла стороной вверх на поддон, покрытый парафиновой пленкой, чтобы сэкономить реагенты и облегчить манипуляции. Сохраняйте и поддерживайте кондиционированную среду при температуре 37 градусов Цельсия для инкубации и промывки.
Инкубируйте клетки с первичными антителами, разведенными в кондиционированной среде при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого с помощью вакуумной пипетки осторожно отсасывают среду, содержащую антитела, и трижды промывают клетки кондиционированной средой.
При изучении экспрессии поверхностных и внутриклеточных рецепторов зафиксируйте клетки параформальдегидом после этого шага, как описано в текстовом протоколе. Поддерживайте клетки в кондиционированной среде без антител и верните их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия для интернализации. Если изучаете процесс интернализации, после этого шага зафиксируйте клетки параформальдегидом, как указано в текстовом протоколе.
Чтобы блокировать эпитопы на первичном антителе, прикрепленном к поверхностно экспрессируемым рецепторам, которые не были интернализованы, инкубируют клетки с неконъюгированными фрагментами анти-IgG-антител Fab, разведенными в кондиционированной среде в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого трижды промойте клетки кондиционированными средами. Инкубируйте промытые лунки с кондиционированной средой, содержащей 80 микромолярных динасор при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы обеспечить рециркуляцию внутренних рецепторов.
После завершения модификаций на живых клетках промойте клетки один раз PBS+. Добавьте в клетки раствор 4% параформальдегида и 4% сахарозы в PBS, и инкубируйте в вытяжном шкафу при комнатной температуре от 7 до 8 минут для фиксации клеток. Затем трижды промыть клетки обычным PBS. Добавьте в клетки раствор 10% нормальной козьей сыворотки в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы блокировать неспецифические участки связывания.
Затем инкубируйте клетки с флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в 3% NGS в PBS при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы пометить рецепторы, меченные первичными антителами. После этого трижды промыть клетки с помощью PBS.
Чтобы начать мечение внутриклеточных рецепторов, добавьте 0,25% раствор Triton-X в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5-10 минут для проникновения клеток. Затем залейте 10% NGS при комнатной температуре на 30 минут. При изучении поверхностного и общего антител инкубируйте клетки с тем же первичным антителом, которое использовалось ранее, разведенным в 3% NGS в PBS при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы пометить внутриклеточные рецепторы.
Далее трижды промойте клетки с помощью PBS. Пометьте вторым флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в 3% NGS в PBS при комнатной температуре в течение одного часа. После этого трижды промыть клетки с помощью PBS. Сначала аккуратно поместите покровные стекла клеточной стороной вниз на 12-15 микролитров подходящей монтажной среды для крепления ячеек. Затем визуализируйте клетки на соответствующем конфокальном микроскопе и проанализируйте клетки, как указано в текстовом протоколе.
Обзор
В данной статье описывается протокол изучения динамики глутаматных рецепторов в культурах нейронов гиппокампа. В ней подробно изложены методы маркировки, фиксации и количественного определения рецепторов, экспрессированных на поверхности, подвергшихся эндоцитозу и подвергшихся рециклизации, с помощью конфокальной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Динамика рецепторов
Теоретические основы
- Понимание динамики глутаматных рецепторов имеет решающее значение для изучения синаптической передачи.
- Эндоцитоз и рециркуляция рецепторов играют важную роль в нейрональной сигнализации.
- Конфокальная микроскопия позволяет детально визуализировать локализацию рецепторов.
- Данное исследование посвящено методологии анализа экспрессии рецепторов в культивируемых нейронах.
Цель исследования
- Изучение механизмов эндоцитоза и рециклинга глутаматных рецепторов.
- Дифференциация между рецепторами, экспрессированными на поверхности, и интернализованными рецепторами.
- Предоставление детального протокола для исследователей, изучающих динамику рецепторов.
Используемые методы
- Подготовка культур нейронов гиппокампа на покровных стеклах.
- Применение первичных антител для маркировки глутаматных рецепторов.
- Использование кондиционированной среды для индукции эндоцитоза.
- Количественное определение динамики рецепторов с помощью конфокальной микроскопии.
Основные результаты
- Успешное мечение поверхностных и эндоцитозированных глутаматных рецепторов.
- Демонстрация рециркуляции рецепторов при специфических условиях.
- Количественный анализ локализации рецепторов при различных вариантах обработки.
- Валидация протокола для последующих исследований динамики рецепторов.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно различать поверхностные и интернализированные рецепторы.
- Полученные результаты способствуют пониманию механизмов трафика глутаматных рецепторов.
- Эта методология может быть применена в различных исследованиях в области нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет точно разграничить популяции поверхностных и интернализованных глутаматных рецепторов, что способствует механистическому снижению рисков при валидации мишеней для терапии расстройств ЦНС. Количественная оценка динамики трафика рецепторов обеспечивает прогностическую уверенность при анализе влияния соединений на синаптическую функцию и пути нейронной передачи сигналов. Этот подход помогает на ранних этапах поиска новых лекарственных средств, проясняя поведение рецепторов при фармакологических или генетических воздействиях, имеющих значение для нейропсихиатрических показаний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы трафика глутаматных рецепторов для подтверждения функционального взаимодействия с мишенью.
- Практическая ценность: позволяет дифференцировать пулы рецепторов, экспрессированных на поверхности, от интернализованных рецепторов с помощью дифференциального мечения антителами и конъюгации флуорофорами.
- Прогностическая ценность: способствует оценке индуцированных соединением изменений в эндоцитозе и рециркуляции рецепторов для оптимизации ведущих соединений-кандидатов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать количественные результаты конфокальной визуализации популяций поверхностных, эндоцитозированных и рециклированных рецепторов в контролируемых условиях.
- Воспроизводимость: использование стандартизированных процедур фиксации, пермеабилизации и последовательного мечения антителами обеспечивает стабильную дифференциацию подмножеств рецепторов.
- Масштабируемость: совместимость с многолуночными форматами и автоматизированной визуализацией позволяет проводить среднепроизводительный скрининг фармакологических модуляторов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Трафик глутаматных рецепторов участвует в дефиците синаптической пластичности, связанном с нейродегенеративными и нейропсихиатрическими заболеваниями.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает механистический переход от динамики рецепторов in vitro к доклиническим моделям дисфункции ЦНС.
- Снижение рисков: Позволяет на ранних этапах выявлять соединения, нарушающие трафик рецепторов, что снижает вероятность отбраковки препаратов на поздних стадиях из-за непредвиденных воздействий на нейроны.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в цикл разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, предоставляя сведения о механизмах действия, которые лежат в основе принятия решений о дальнейшем продвижении соединений.
- Открывающая биология: позволяет проверить гипотезы о путях трафика рецепторов и уточнить влияние соединений на локализацию глутаматных рецепторов.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных данных о поверхностной экспрессии и скорости интернализации рецепторов, готовых для анализа, с целью оценки соединений.
- Аналитика: позволяет сравнивать популяции рецепторов при различных вариантах обработки с помощью количественного анализа методом конфокальной микроскопии для оценки зависимости «структура — активность» (SAR) и potency.
- Трансляционные исследования: связывают данные о трафике in vitro с доклиническими исследованиями путем выявления соединений, которые сохраняют или нарушают физиологический цикл рецепторов.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для оценки соединений, нацеленных на ЦНС, в рамках нескольких проектов и классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает снижение механистических рисков, позволяя определить, изменяют ли соединения доступность глутаматных рецепторов на поверхности клетки по сравнению с их общим уровнем экспрессии.
- Практическая ценность: гарантирует воспроизводимость результатов за счет стандартизированных рабочих процессов добавления антител, пермеабилизации и двухфлуоресцентного мечения.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), выявляя субклеточные механизмы действия, которые могут предсказать функциональные результаты в нейронных сетях.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию соединений с учетом рисков на основе их воздействия на рециркуляцию рецепторов, что является ключевым определяющим фактором синаптической устойчивости.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами нейронов, маркировкой антителами и конфокальной микроскопией.
- Необходимо наличие флуоресцентно-меченных вторичных антител, агентов пермеабилизации (например, Triton-X) и модуляторов эндоцитоза (например, dynasore).
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами в отношении времени фиксации, концентраций антител и протоколов анализа изображений.
- Адаптация метода для других типов рецепторов или моделей нейронов требует валидации специфичности антител и кинетики трафика.
- Практические ограничения включают вариабельность при подготовке первичных культур и необходимость тщательной оптимизации этапов блокировки и пермеабилизации для предотвращения появления артефактов.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Мышиные лимфоцит Этикетировочное по
Похожие видео
0 Просмотры
Высоким содержанием пробирного контроля АМПА рецептор людьми
Похожие видео
0 Просмотры
Отслеживание индуцированного биспецифическими антителами трафика Т-клеток с использованием Т-клеток человека, трансдуцированных люциферазой
Похожие видео
0 Просмотры
Боковая диффузия и экзоцитоз мембранных белков в культивируемых нейронов оценивали по флуоресценции и флуоресценции восстановления потерь фотообесцвечивания
Похожие видео
0 Просмотры
Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли
Похожие видео
0 Просмотры
Комбинированный оптогенетика и сублимационной перелом реплики иммунноокрашивания по анализу Устройство ввода специфических рецепторов глутамата у мышей Amygdala
Похожие видео
0 Просмотры
Использование ферментных биосенсоров на основе измерить Тоник и фазовый глутамат в мышиных моделях болезни Альцгеймера
Похожие видео
0 Просмотры
Измеряя эндоцитоза синаптических пузырьков в культивированный Нейроны гиппокампа
Похожие видео
0 Просмотры
Assay высок объём кальция потока для изучения NMDA-рецепторов с чувствительностью к глицин/D-серина и глутамата
Похожие видео
0 Просмотры
Подход к кормлению антител для изучения торговли рецепторами глутамата в диссоциированных первичных гиппокампальных культурах
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026