Методика in vitro для изучения трафика глутаматных рецепторов в нейронах гиппокампа

Возьмите три образца культур нейронов гиппокампа на покровных листах.

Введите первичные антитела для маркировки поверхностно экспрессируемых глутаматных рецепторов.

Добавьте кондиционированную среду ко второму и третьему образцам, чтобы индуцировать эндоцитоз рецепторов, связанных с антителами.

На третьем образце добавьте Fab-фрагменты для блокирования эпитопов на неэндоцитозированных антителах.

Введите ингибитор для блокирования эндоцитоза рецепторов, позволяя рецептору возвращаться на поверхность.

Во всех образцах зафиксируйте ячейки и добавьте блокирующий раствор, чтобы предотвратить неспецифическую маркировку.

Введение вторичных антител, меченных флуорофорами, для мечения первичных антител на поверхностно связанных рецепторах, включая рециркулированные.

Проникают в клеточные мембраны.

Добавьте первичное антитело снова к первому образцу, чтобы пометить ранее существовавшие эндоцитозные рецепторы.

Введите во все образцы другое вторичное антитело, помеченное флуорофорами, для маркировки первичных антител, связанных с эндоцитозированными рецепторами, различая эндоцитозированные и поверхностно связанные рецепторы.

Используя конфокальный микроскоп, количественно оцените поверхностно-