Оценка индуцированного Т-клеточными рецепторами притока кальция с помощью красителя-индикатора кальция

Начните с суспензии Т-клеток мыши и введите индикаторный краситель кальция — индо-1-ацетоксиметиловый эфир.

Краситель проникает в клетки, где внутриклеточные эстеразы расщепляют ацетоксиметиловую группу, образуя непроницаемый для мембраны Indo-1, который проявляет отчетливую флуоресценцию в формах, свободных от кальция и связанных с кальцием.

Добавьте антитела к Fc-рецепторам для блокирования неспецифических сайтов взаимодействия.

Введение меченых флуорофорами антител в окрашивание субпопуляций Т-клеток.

Удалите несвязанные антитела и окрасите их с помощью красителя для жизнеспособности, который дифференциально окрашивает живые и мертвые клетки.

При проточной цитометрии сначала обнаруживают тусклую флуоресценцию живых клеток и идентифицируют меченые флуорофорами Т-клетки, а затем измеряют флуоресценцию Indo-1 в этих клетках.

Лечение анти-CD3 антителами, которые взаимодействуют с комплексом CD3 Т-клеточного рецептора и активируют сигнальные пути Т-клеток, индуцируя приток кальция в цитозоль.

Краситель Indo-1 взаимодействует с высвобожденными ионами кальция, смещая флуоресценцию красителя с синей на фиолетовую.

Сдвиг флуоресценции Indo-1 из состояния, свободного от кальция, в состояние, связанное с кальцием, подтверждает индуцированный рецептором кальция Т-клетками.

Для начала приготовьте 1 микрограмм на микролитр стокового раствора Indo-1 AM, добавив 50 микролитров ДМСО во флакон, содержащий 50 микрограммов Indo-1 AM. Развести исходный раствор до соответствующего объема cRPMI в концентрации 6 мкг на миллилитр.

Поместите среду на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Затем с помощью этой среды разбавьте заранее приготовленную клеточную суспензию в соотношении 1 к 1, чтобы получить от 5 до 6 миллионов клеток на миллилитр. Затем в 12-луночный планшет для культивирования тканей добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии на лунку в расчете на экспериментальное условие.

Подготовьте контрольный образец с одним окрашиванием для Indo-1 AM, не содержащего кальция, добавив EGTA к клеткам, загруженным красителем Indo-1. Отремонтируйте лунку для биологически негативного контроля без флуорофоров или красителя Indo-1. Готовят положительный контроль Indo-1 путем добавления иономицина в концентрации 50 мкм к суспензии клеток, нагруженных красителем, на проточном цитометре.

Кроме того, подготовьте лунку для контроля дополнительных клеточных популяций с использованием флуорофоров, конъюгированных с антителами. Затем добавьте 2 микрограмма антитела, блокирующего рецептор ФК, на миллион клеток и инкубируйте планшет в течение 45 минут, постукивая каждые 15 минут для ресуспендирования клеток.

После инкубации перемешайте и удалите весь объем клеток из планшета и добавьте его в 1,7-миллилитровые микроцентрифужные пробирки. Центрифугируйте и сцедите надосадочную жидкость. После того, как клетки промыты 1 миллилитром предварительно подогретого cRPMI, снова скатите гранулы и сцедите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте клетки в 1 миллилитре cRPMI и инкубируйте каждую пробирку, оставляя верхнюю часть пробирки слегка открытой для газообмена, что позволяет полностью деэтерифицировать внутриклеточные эфиры AM. Далее приготовьте мастер-смесь из всех определенных пользователем фторохром-конъюгированных антител, и добавьте ее в покоящиеся клетки в количестве 1 миллилитра объема клетки.

После отдыха окатывают ячейки, а гранулы промывают, повторно суспендируя в 1 миллилитр cRPMI, охлажденного до 4 градусов Цельсия. Повторите этот шаг и поместите трубки на лед. Суспендировать отдельные образцы в 500 микролитрах фенола без красного cRPMI с помощью проточной трубки из полистирола объемом 5 миллилитров с колпачком.

Чтобы поддерживать температуру с помощью анализа кальциевого флюса, приготовьте ванну с шариками, добавив шарики в небольшую водяную баню, и нагрейте ее до 37 градусов по Цельсию. Аккуратно разрежьте 50-миллилитровую коническую трубку пополам и выбросьте верхнюю часть трубки. Заполните оставшуюся трубку шариками для ванны на 3/4 и дайте ей нагреться до 37 градусов Цельсия в ванночке для шариков.

Поместите ванночку с шариками рядом с проточным цитометром вместе с штативом из пенополистирола для установки трубки. Перед анализом на проточном цитометре прогрейте трубки по отдельности до 37 градусов Цельсия в течение семи минут. Войдите в программное обеспечение проточного цитометра и перейдите на вкладку «Библиотека».

Затем выберите флуоресцентные метки, чтобы добавить связанный с кальцием Indo-1 и Indo-1 без кальция. Затем выберите УФ-лазер в группе флуоресцентных меток и нажмите «Плюс» Добавить, чтобы добавить имя флуоресцентной метки. Выберите длину волны возбуждения и излучения лазера, а затем нажмите кнопку Сохранить.

Перейдите к настройке эксперимента. Перейдите на вкладку Получение. Откройте или создайте новый эксперимент и добавьте в эксперимент нужные флуоресцентные метки. Создайте контрольную группу и новую выборочную группу для эксперимента и пометьте обе группы.

На вкладке Приобретения задайте для событий максимум 10 миллионов, объем остановки — до 3 000 микролитров, а время остановки — до 36 000 секунд. Получите одноокрашенные контрольные элементы для определяемых пользователем конъюгированных антител, включенных в многоцветную панель, и для функционального красителя Indo-1.

Добавьте 50 микромолей иономицина к связанному с кальцием положительному контролю Индо-1 и вихрю. Добавьте проточную трубку на плату для впрыска образца и нажмите кнопку «Запись». Затем добавьте не содержащий кальция Indo-1 отрицательный контроль в проточный цитометр и нажмите «Запись».

Размешайте элементы управления с одним пятном, нажав на кнопку «Отменить смешивание». После завершения расмешивания создайте последовательные графики с помощью рабочего листа без смешивания, такие как SSCA против FSCA для удаления мусора из образца и SSCA против SSCH для удаления дублетов.

Затем создайте ворота, нажав на кнопку «Плотить». Добавьте график на лист и дважды щелкните внутри ворота, чтобы создать расположенное ниже по течению закрытое население. Продолжайте до тех пор, пока не будут учтены все интересующие вас популяции. Далее подогрейте предварительно подготовленные одинарно окрашенные контрольные образцы до 37 градусов Цельсия для последовательного анализа.

Настройте программное обеспечение для проточной цитометрии и запустите деионизированную воду в течение 2–3 минут, чтобы обеспечить жидкую стабильность проточного цитометра. Настройте последовательные графики на листе без смешивания, создав стробы с помощью кнопок многоугольника, прямоугольника или эллипса для параметра Включить интересующую популяцию.

Дважды щелкните внутри ворот и измените параметры по осям Y и X на SSCA вместо SSCH. Завершите определение параметров оси, щелкнув левой кнопкой мыши по оси. Создание графика с использованием SSCA в зависимости от сигнала красителя жизнеспособности. Затвор живым клеткам, которые окрашиваются отрицательным или аминовым красителем.

Живые клетки, отрицательные для окрашивания живыми мертвыми, будут группироваться на нулевой отметке как по оси y, так и по оси x. Дважды щелкните по внутреннему графику, чтобы создать новый график, содержащий только одноклеточные живые лимфоциты. Измените ось Y на единицу зависимости от времени по оси X для визуализации притока кальция.

Затем поместите нагретый биологический образец в SIT машины. Прогоните образцы со скоростью от 2500 до 3000 событий в секунду со средней скоростью потока, чтобы визуализировать приток кальция в ограниченном числе клеточных популяций. Добавьте следующую трубку в ванночку с шариками.

В окне «Управление сбором» нажмите кнопку «Запись», чтобы записать исходные данные в течение 30 секунд и получить базальный уровень кальциевой сигнализации в образце. Затем нажмите «Стоп» и извлеките пробирку из порта для введения образца. Добавьте 30 мкг неконъюгированного анти-CD3 непосредственно в пробирку с образцом, чтобы инициировать приток кальция.

Быстро поместите пробирку обратно в порт для впрыска образца и нажмите кнопку «Запись» в программном обеспечении. Записывайте данные в течение семи минут, наблюдая за временем, прошедшим под контролем сбора данных в программном обеспечении. Затем нажмите Стоп в программе.