Оценка индуцированного Т-клеточными рецепторами притока кальция с помощью красителя-индикатора кальция

Начните с суспензии Т-клеток мыши и введите индикаторный краситель кальция — индо-1-ацетоксиметиловый эфир.

Краситель проникает в клетки, где внутриклеточные эстеразы расщепляют ацетоксиметиловую группу, образуя непроницаемый для мембраны Indo-1, который проявляет отчетливую флуоресценцию в формах, свободных от кальция и связанных с кальцием.

Добавьте антитела к Fc-рецепторам для блокирования неспецифических сайтов взаимодействия.

Введение меченых флуорофорами антител в окрашивание субпопуляций Т-клеток.

Удалите несвязанные антитела и окрасите их с помощью красителя для жизнеспособности, который дифференциально окрашивает живые и мертвые клетки.

При проточной цитометрии сначала обнаруживают тусклую флуоресценцию живых клеток и идентифицируют меченые флуорофорами Т-клетки, а затем измеряют флуоресценцию Indo-1 в этих клетках.

Лечение анти-CD3 антителами, которые взаимодействуют с комплексом CD3 Т-клеточного рецептора и активируют сигнальные пути Т-клеток, индуцируя приток кальция в цитозоль.

Краситель Indo-1 взаимодействует с высвобожденными ионами кальция, смещая флуоресценцию красителя с синей на фиолетовую.

Сдвиг флуоресценции Indo-1 из состояния, свободного от кальция, в состоян