Анализ для количественной оценки связывания VLP норовируса человека с кишечными бактериями

Возьмите тюбик, содержащий суспензию кишечных бактерий человека.

Добавьте вирусоподобные частицы норовируса человека, или VLP. VLP содержат интактный вирусный капсид, но не имеют геномной РНК, что делает их незаразными для человека.

Во время инкубации белки капсида VLP связываются со специфическими углеводами, экспрессируемыми на поверхности бактерий, образуя комплексы VLP-бактерий.

Центрифуга для гранулирования комплексов и выброса несвязанных VLP.

Введите содержащий белок блокирующий раствор для блокирования неспецифических сайтов связывания антител, уменьшая фоновое окрашивание на последующих этапах.

Добавьте флуоресцентно меченые VLP-специфические антитела и инкубируйте.

Антитела связываются со своими сайтами-мишенями на капсиде VLP, помечая комплексы VLP-бактерий.

Центрифуга для гранулирования комплексов. Выбросьте несвязанные антитела и повторно суспендируйте гранулу в буфере для проточной цитометрии.

С помощью проточного цитометра можно обнаружить флуоресцентные сигналы, излучаемые комплексами VLP-бактерий, что позволяет количественно оценить процентное содержание связанных бактерий в образце.

После подготовки реагентов, антител и бактерий, как описано в рукописи, соберите все материалы в шкафу биобезопасности BSL II.

Вирусоподобные частицы для норовируса человека занесены в список патогенов BSL II, и все работы, выполняемые с использованием VLP, должны проводиться в сертифицированном шкафу биобезопасности.

Добавьте 10 микрограммов норовируса человека VLP в каждую пробирку с бактериями и тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Инкубируйте пробирки в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия при постоянном вращении. После инкубации центрифугируйте пробирки при 10 000-кратном избежании в течение 5 минут.

Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактериальную гранулу в 1 миллилитре PBS. Повторив этапы промывки один раз, снова центрифугируйте пробирки при 10 000 раз g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу бактерии VLP в 150 микролитрах 5% блокирующего буфера.

Распространенная ошибка заключается в том, что трубки меняются местами и добавляется неправильное лечение. Чтобы этого не допустить, расположите все пробирки в линии, соответствующие правильному лечению, и добавьте к пробиркам сразу одну обработку.

Для каждого бактериального образца приготовьте 50 микролитров разведенного антитела к норовирусу человека G2. Используя 5% блокирующий буфер, разбавьте антитело от 1 до 125 для образцов случая E. coli. Приготовьте 50 микролитров разведенного антитела изотипа для каждого бактериального образца с использованием тех же коэффициентов разведения. Разделите каждый образец пробирного анализа на аликвоты объемом 350 микролитров, переложив их в чистые центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Чтобы создать неокрашенный контроль, добавьте 50 микролитров блокирующего буфера в первую аликвоту из каждого образца бактерии. Для окрашенных образцов добавьте 50 микролитров разведения антител G2 ко второму набору аликвот. Создайте контроль изотипа, добавив 50 микролитров разведенного антитела изотипа к третьему набору аликвот.

Инкубируйте все образцы на льду и в темноте в течение 30 минут. Затем центрифугируйте все образцы при 10 000 умноженных на g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждый образец в 150 микролитрах FCSB. Снова центрифугируйте все образцы при 10 000 умноженных на g в течение 5 минут. Снова выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте образцы в 100 микролитрах FCSB.

После центрифугирования образцов в последний раз и отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте образцы в 150 микролитрах FCSB. Переложите каждый образец в пробирку, содержащую 400 микролитров FCSB общим объемом 550 микролитров. Храните образцы при температуре 4 градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут проанализированы с помощью проточной цитометрии.