Анализ in vivo для выявления митофагии у трансгенных нематод

Возьмем, к примеру, трансгенных нематод, в которых мышечные клетки стенки тела экспрессируют зеленый флуорофор DCT-1, внешний белок митохондриальной мембраны, и красный флуорофор LGG-1, фагофорный мембранный белок.

Поместите червей поверх питательной среды, содержащей препарат, вызывающий митофагию.

Препарат повреждает клеточные митохондрии, инициируя митофагию или избирательный клиренс поврежденных митохондрий.

DCT-1 на поврежденных митохондриях подвергается убиквитинации и фосфорилированию, облегчая взаимодействие с LGG-1 на мембране фагофора.

Фагофор расширяется вокруг митохондрий, образуя аутофагосому, предназначенную для лизосомальной деградации.

Поместите нематод в анестетик на предметное стекло микроскопа, чтобы обездвижить их, и установите покровный стебель.

Под флуоресцентным микроскопом визуализируйте желтые пятна в мышечных клетках, указывающие на совместную локализацию DCT-1, излучающего зеленую флуоресценцию, и LGG-1, проявляющего красную флуоресценцию. Это подтверждает возникновение митофагии.

В первый день выберите личинки L4 трансгенных животных, экспрессирующие как DCT-1::GFP, так и DsRed::LGG-1 в мышечных клетках стенки тела, и поместите их на тарелку для роста не