Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 7:32 мин. • July 8th, 2025
Чтобы обнаружить биомаркер белка, ассоциированного с заболеванием, возьмите иммуноферментную пластину.
Пластина содержит предварительно заполненные матрицы разделения и укладки, необходимые для разделения белков по размеру.
Загрузите белки и реагенты для иммуноферментного анализа в отдельные лунки планшетов.
Запустите прогон внутри анализатора CEI. Капиллярный картридж в анализаторе отсасывает матрицы, образуя гель внутри каждого капилляра.
Затем капилляр отсасывает белки. Во время электрофореза белки мигрируют и разделяются в зависимости от их молекулярной массы.
Анализатор вводит ультрафиолетовый свет, обездвиживая белки в капилляре.
Промывочный буфер удаляет матрицы и несвязанные белки. Затем буфер блокировки блокирует, блокируя неспецифические сайты взаимодействия.
Анализатор вводит первичные антитела, которые связываются с биомаркером, за которыми следуют пероксидаза-конъюгированные вторичные антитела, взаимодействующие с первичными антителами.
Вымыть, а затем добавить хемилюминесцентный субстрат. Пероксидаза окисляет подложку, выделяя люминесценцию.
Измерьте интенсивность люминесценции и сравните ее со стандартом белка для обнаружения биомаркеров.
После сбора 100 микролитров лизатов тромбоцитов человека у пациентов с БАС и здоровых субъектов заполните собственные шаблоны для компоновки капилляров и подготовки образцов. Таблица подготовки образцов смеси является динамической и автоматически рассчитает, какой объем должен быть удален из источника. Поместите все реактивы для анализа на лед, кроме стандартной упаковки, которая должна оставаться при комнатной температуре.
Чтобы приготовить флуоресцентную мастер-смесь, добавьте 40 микролитров деионизированной воды в прозрачную пробирку с DTT, а в розовую пробирку из набора для анализа добавьте 20 микролитров буфера для образца 10X и 20 микролитров приготовленного 400-миллимолярного раствора DTT.
Чтобы приготовить биотинилированную лестницу, добавьте 16 микролитров деионизированной воды, 2 микролитра буфера для образца 10X и 2 микролитра приготовленного 400-миллимолярного раствора DTT в белую пробирку, предоставленную в комплекте. После аккуратного перемешивания переложите раствор лестницы в 200-микролитровую ПЦР-пробирку перед денатурацией.
Добавьте 1,5 микролитра 10-кратного буфера для проб и 148,5 микролитров деионизированной воды в микроцентрифужную пробирку объемом 600 микролитров и перемешайте, прежде чем поместить пробирку на лед. Добавьте интересующие антитела непосредственно в разбавитель, как указано в таблице, и промойте наконечник пипетки несколько раз для получения однородного раствора антитела.
Чтобы приготовить смесь для капиллярных образцов, откройте все пробирки для ПЦР и добавьте 1,6 микролитра аликвот флуоресцентного буфера для образцов 5X в каждую пробирку, как указано в таблице, используя технику обратного пипетирования, немедленно закрывая каждую пробирку по мере добавления буфера. Когда весь буфер будет добавлен, откройте все пробирки и добавьте 0,1x буфер для проб в объеме, как указано в таблице, немедленно закрывая каждую пробирку по мере добавления буфера.
Затем откройте все пробирки и добавьте образцы белка, как указано в таблице, и немедленно закройте крышку каждой пробирки. Когда все образцы будут добавлены, кратковременно центрифугируйте все пробирки в настольной центрифуге. Вортекс перемешать, и снова центрифугировать образцы.
В конце второго центрифугирования поместите все пробирки в термоамплификатор с нагреваемой крышкой и денатурируйте образцы в указанных условиях. В конце денатурации центрифугируете, перемешайте и снова центрифугируйте образцы, а затем поместите все пробирки в штатив для пробирок на лед.
Используя рисунок в качестве ориентира, добавить по 10 микролитров стрептавидина хренпероксидазы в лунку D1, по 10 микролитров соответствующего вторичного антитела в лунки от D2 до D5, по 10 микролитров разбавителя антитела к каждой лунке в ряду В и в лунку С1, по 10 микролитров соответствующего первичного антитела в лунки с С2 по С25, 5 микролитров биотинилированного лесенка из ПЦР-пробирки No 1 в лунку А1, 3 микролитра образца на ряды от А2 до А25 и 15 микролитров свежеприготовленной перекиси люминола на каждую лунку ряда Е.
Пипетирование смеси образцов и реагентов в крошечную лунку в правильном порядке имеет решающее значение для успеха эксперимента, поэтому его следует проводить очень осторожно.
Затем добавьте 500 микролитров буфера для промывки в каждую предназначенную для промывки лунку и уменьшите содержимое пластины путем центрифугирования.